环境水样中地塞米松的酶联免疫法测定

吴小胜 刘 萤 崔廷婷 何方洋* 冯 鑫 贾超伟 崔凤云

（①北京勤邦生物技术有限公司 北京 昌平 102206 ②北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心 ③北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 ④北京市门头沟区动物疫病预防控制中心）

地塞米松(dexamethasone)是医学临床应用最广泛的糖皮质激素类药物，可用于治疗自身免疫性疾病、过敏、哮喘等，具有抗炎和抗过敏的作用[1]，也是家畜、家禽饲养中常用的药物之一[2]。地塞米松在应用过程中，其药物残液可经各种途径污染环境，也可从应用者体内经分泌液和尿液排出，污染更广泛的水环境[3]，目前已有关于水体中地塞米松污染的报道[4,5]。而污水或废水中的地塞米松可进入到城市地表水、地下水中，由于其具有较强的持久性、生物活性、生物累积性和缓慢生物降解性[6]，且目前尚无处理废水中激素类残留物的有效措施[7]，导致城市水体系在往复循环过程中药物的不断累积和暴露水平的不断升高，形成污染物长期暴露于人体和水生、陆生生物的风险，进而将给人类健康和生态环境带来潜在风险[8,9]，因此地塞米松在水体中的残留不可忽视。

地塞米松的测定，文献报道多为检测血液、尿液中的含量或检测动物源性食品中的残留，主要方法是液质联用法[10,11]、气质联用法[12]。这些方法准确度好，但是对于环境中微量物质的测定，往往不能达到所需的灵敏度，而且对仪器条件要求高，前处理操作复杂，耗时较长，不能满足快速监测的需要。酶联免疫吸附分析方法(ELISA)具有灵敏度高、特异性好、价廉、简便和快速的特点，已广泛用于环境样品的检测。本研究通过化学合成具有抗原活性的地塞米松免疫抗原，成功获得了高特异性、高亲和性的地塞米松单克隆抗体，同时开发了检测水质中地塞米松的酶免疫检测ELISA试剂盒，为检测机构和生产厂家提供了高效、快速的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 地塞米松、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵清蛋白(ovalbumin, ΟVA)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)：美国Sigma公司；8周龄的雌性Balb/c小鼠、无病原体羊：北京勤邦生物技术有限公司；水样本：北京安为天检测技术有限公司。

1.1.2 仪器与设备 MK3酶标仪：上海雷勃分析仪器有限公司；Costar酶标板：北京诺博莱德科技有限公司；TDL-40B离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制备 （1）半抗原的制备：0.80g地塞米松溶于5ml二甲基亚砜(DMSΟ)中，60℃下缓慢滴加入0.5ml 1,3-丙二胺和0.5ml吡啶在10ml DMSΟ的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂和未反应的丙二胺，定量得到地塞米松的丙二胺单缩合物，合成路线如图1所示。

图1 地塞米松半抗原的合成

（2）免疫原的制备：取碳二亚胺(EDC) 50 mg用2ml水使之充分溶解得到溶液I；取地塞米松半抗原11mg用1.0ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解得到溶液II；取BSA 60mg溶于3ml 0.01mol/L PBS(pH=8.0)溶液中得到溶液Ⅲ；将溶液Ⅱ与溶液Ⅲ混合，在磁力搅拌下逐滴加入溶液I；室温下搅拌反应24h。用三蒸水透析48h，得到免疫原。（3）包被原的制备：取地塞米松半抗原15mg用1.0ml DMF溶解得到溶液IV；取50%的戊二醛10µl加入溶液IV中，室温下

基金项目：北京市科技计划课题——城市地下水和地表水中PPCPs微污染物新型检测技术、降解工艺及专项设备的研发(课题编号：Z151100002115059)

*通讯作者搅拌反应18h得到溶液V；取ΟVA 40mg用3ml水稀释后加入溶液V中；反应过夜后加入24mg NaBH4反应3h；用三蒸水透析48h，得包被原。

1.2.2 单克隆抗体的制备及效价验证 将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150µg/只，使其产生多克隆抗体[13]。取血清测定结果较高的小鼠的脾细胞进行融合和克隆化，建立稳定分泌地塞米松单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用体内诱生法及辛酸-饱和硫酸铵法[14]纯化得到地塞米松单克隆抗体溶液。

1.2.3 制备酶标记抗体 用得到的地塞米松单克隆抗体免疫无病原体羊，得到的羊抗鼠抗体进行辣根过氧化物酶标记，即得到酶标记抗体。

1.2.4 优选抗原包被浓度、单克隆抗体浓度 抗原稀释倍数依次为：1∶4000、1∶8000、1∶16000；单克隆抗体稀释倍数依次为：1∶20000、1∶40000、1∶80000、1∶160000；酶标记抗体的稀释倍数为1∶1000；测定波长为450nm，分别测定0、0.1µg/L质量浓度的地塞米松标准品的吸光度值，并按如下公式计算百分吸光率：百分吸光率(即抑制率)=(0.1µg/L标准溶液的平均吸光度值/0µg/L标准溶液的平均吸光度值)×100%。

1.2.5 样本的前处理方法 取水样100µl至2ml离心管中，加入400µl 0.1mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.2)，用涡旋仪充分涡动，混匀；取100µl用于分析。

1.2.6 标准曲线的建立 用0.02mol/L PBS将地塞米松稀释成0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1µg/L共6个质量浓度，加入包被有包被原的酶标板微孔，100µL/孔，然后加入单克隆抗体工作液50µL/孔，25℃避光环境下竞争30min。洗板拍干后加入酶标记抗抗体100µl/孔，25℃避光反应30min。洗板拍干后加入底物液100µl/孔，25℃避光反应15min，最后每孔加入50µl终止液，于波长450nm处检测[15]。以质量浓度为0µg/L时的ΟD值为B0值，相应地塞米松质量浓度的ΟD值为B值，以评定模型Logit(B/B0)为纵坐标，以地塞米松标准品质量浓度(µg/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。

1.2.7 样品中地塞米松的检测 根据所得的标准曲线，将水样的ΟD450nm值代入标准曲线，即可得到其相应的质量浓度，用该质量浓度乘以稀释倍数即可知样本中地塞米松残留量。

1.2.8 ELISA方法的评价 （1）敏感性试验：用半数抑制浓度(IC50)和检测限来评价方法的灵敏度。测定20次标准曲线的IC50，统计其平均值和浮动范围；测定20个环境水样空白样本，计算其B/B0在标准曲线上对应的质量浓度的平均值和标准差，以平均值加3倍的标准差作为方法的检测限，即可检测出的最低被测物浓度。（2）准确性和重复性试验：用回收率和变异系数分别来评价ELISA方法的准确性和重复性。按0.5、1、2µg/L三个浓度的地塞米松对环境水样进行添加回收测定，每个样品浓度做4个重复，用三批不同试剂进行测定，计算回收率和批内、批间变异系数。（3）稳定性试验：将ELISA方法涉及到的各种试剂制备足量保存于37℃环境中，每隔1d取出适量，分别测定0µg/L标准品的ΟD450nm值、IC50及按上述方法进行添加回收实验所得的回收率，直到方法的灵敏度和回收率开始下降为止，根据实验结果判断相关试剂的稳定性。

2 结果与讨论

2.1 地塞米松人工抗原检测结果

取合成的半抗原经核磁共振氢谱鉴定，如图2所示，图谱中6.5～7.0µl/L之间的烯烃峰向高场移动，1.0～2.5µl/L之间增加的亚甲基峰说明半抗原合成成功。

图2 地塞米松半抗原核磁共振氢谱图

2.2 优选抗原包被浓度、单克隆抗体浓度

测定不同单克隆抗体稀释倍数以及抗原稀释倍数条件下，质量浓度为0和0.1µg/L的地塞米松标准品的ΟD450值，并计算百分吸光率(表1)。当百分吸光率在70%～85%时，以抗原、单克隆抗体的最大稀释倍数作为抗原、单克隆抗体的最佳稀释倍数，结果表明，此次筛选的抗原稀释倍数为8 000，最佳单克隆抗体稀释倍数为80000。

表1 抗原、抗体的浓度优选结果 （%、µl/L）

2.3 标准曲线的确定

在0.1～8.1µg/L质量浓度范围内，Logit(B/B0)与地塞米松质量浓度对数呈现良好的线性关系(见图3)，建立拟合回归直线方程为Y=﹣2.1426X﹣0.9884，相关系数R2=0.9965，半数抑制浓度(IC50)为0.337µg/L。

图3 地塞米松标准曲线

2.4 敏感性测定

统计20次标准曲线的IC50平均值为0.306µg/L，浮动范围为0.218～0.443µg/L；20个空白环境水样的B/B0在标准曲线上对应的质量浓度见表2。经计算，检测结果平均值为0.298µg/L，标准差为0.066µg/L，因此最低检测限为0.496µg/L，实际应用以0.5µg/L计。

表2 空白环境水样本检测限测定结果 (µg/L)

2.5 准确性和重复性测定

样本中地塞米松的残留量测定，要求有可靠合理的检测方法，并有较高的灵敏度。在环境水样中按照设定的量分别添加地塞米松标准品，然后按照1.3.6的方法测定，平均回收率在75%～105%之间；批内、批间变异系数均＜15%，说明此检测方法是可靠的，可用于地塞米松在环境水样中残留量的分析测定，结果见表3。

表3 精密度及准确度试验结果 (µl/L、%)

2.6 稳定性测定

经测定，涉及到的各种试剂能在37℃条件下稳定保存9d；第10天开始各项参数出现下降。根据生化试剂在37℃每稳定1d，可相当于4～10℃保存一个半月[16]，可知，若将这些试剂组装成商品化试剂盒，可在4℃条件下至少稳定保存12个月。

3 结论

张瑞等[12]建立了采用气相色谱-质谱联用法测定人体尿液中地塞米松的方法，其方法检出限为0.06mg/L；孙清荣等[17]建立了鸡肉中地塞米松残留量的高效液相色谱-串联质谱的测定方法，其方法检出限为0.2µg/L。GB/T 22978-2008《牛奶和奶粉中地塞米松残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》和GB/T20741-2006《畜禽肉中地塞米松残留量测定 液相色谱-串联质谱法》也均为仪器方法，其方法检出限均为0.2µg/L。仪器条件要求高，前处理操作复杂，且暂无文献报道关于水质样本方面的研究，不能满足快速监测的需要。本研究所建立的地塞米松间接竞争酶联免疫检测方法，标准曲线范围为0.1～8.1µg/L，对环境水样的检出限为0.5µg/kg，平均回收率在75%～105%；批内、批间变异系数均小于15%，可用于环境水样中地塞米松的快速检测。酶联免疫法具有灵敏度高、特异性好、操作简单、成本低、高通量等特点，能够满足企业及政府监督部门的检查工作需求。