Syndecan-2与VEGF在RA患者血清和关节滑膜组织中的表达及意义

舒庆雪，徐源，何成松

(西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

类风湿关节炎(RA)是一种以滑膜细胞增生、骨和软骨破坏、血管新生为基本病理改变的自身免疫性疾病。其中，持续的血管新生一方面为滑膜细胞增生提供营养物质，另一方面亦使更多的炎性因子和细胞因子浸润滑膜，促进并维持血管翳的形成[1]。研究发现血管内皮生长因子(VEGF)在RA患者滑膜组织及血浆中高表达，与疾病活动性相关并加重疾病发展[2,3]，因此，VEGF过度表达是导致RA滑膜血管翳形成的关键。近期，有研究发现多配体蛋白聚糖-2(SDC-2)通过调控内皮细胞的迁移在血管新生过程中扮演重要角色，且需与VEGF相互结合方能发挥作用[4,5]。并有实验表明SDC-2在RA滑膜组织血管中高度表达[6]。而目前SDC-2作为膜受体与RA的血管新生及疾病活动研究甚少，并鲜有提及与VEGF的关系。2018年1～2月，我们通过ELISA和免疫组化法分别对RA患者外周血和关节滑膜组织中的SDC-2和VEGF表达进行检测，并探讨二者与疾病活动的相关性，为RA的诊断治疗寻找新的靶点。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年8～12月于西南医科大学附属医院风湿免疫科住院的RA患者49例(病例组)，男15例、女34例，年龄25～68(54.38±9.07)岁。RA患者关节压痛个数及关节肿痛个数分别是(13.02±9.58)、(7.41±8.32)个，C反应蛋白(CRP)为(50.49±54.78) mg/L、红细胞沉降率(ESR)为(79.22±35.58) mm/h、类风湿因子(RF)为(177.45±143.71) IU/mL、抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体(MCV)为(373.47±291.04)U/mL、28个关节疾病活动指数(DSA28)评分为(5.19±1.44)分。另收集5例于四川大学华西医院行关节置换RA患者的关节滑膜组织标本，男1例、女4例，年龄43～67(58.60±9.29)岁。患者均符合美国风湿病学会及欧洲风湿病防治联合会发布的2010年ACR/EULAR的类风湿关节炎分类标准，并排除感染、肿瘤和其他风湿免疫性疾病。患者对本研究知情同意。选取西南医科大学附属医院健康体检者30例作为对照组，男9例、女21例，年龄26～64(51.6±7.01)岁。收集3例于西南医科大学附属医院骨科行关节置换骨关节炎(OA)患者的关节滑膜组织标本为对照组，男1例、女2例，年龄44～64(55.67±10.41)岁。

1.2 血清SDC-2、VEGF检测 分别采集病例组及对照组清晨空腹外周静脉血5 mL，室温静置30 min后离心分离血清(3 000 r/min，10 min)，取血清置于-80 ℃保存。采用双抗体夹心ELISA法检测血清SDC-2、VEGF水平。每板同时设空白对照、阳性对照、正常对照，每一标本均设复孔。严格按照操作指南进行ELISA 检测，质量控制和定标结果均在要求范围内。

1.3 关节滑膜组织中SDC-2、VEGF表达检测 采用免疫组化Envision法检测。类风湿性关节炎滑膜组织切片为阳性对照，骨关节炎滑膜组织切片为正常对照，磷酸盐缓冲液(PBS)为阴性对照。操作步骤：常规脱蜡和水化；高压抗原修复；消除内源性酶活性；滴加一抗，27 ℃孵育1 h；滴加二抗；DAB 显色；苏木素复染；稀盐酸分化，饱和碳酸锂反蓝；脱水、透明、封片。结果判定：SDC-2、VEGF以胞质出现明显的棕黄色颗粒为阳性。染色强度计分标准:无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞率计分标准：阳性细胞数<5% 为0分,5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分;结果根据阳性细胞率和染色强度评分乘积进行综合评定：0～2分为阴性(-)，3～4分为阳性(+)，5～8分为中等阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

2 结果

2.1 病例组与对照组血清SDC-2、VEGF水平比较 病例组与对照组血清SDC-2水平分别为(159.23±59.17)、(112.39±21.54)pg/mL，VEGF水平分别为(85.13±91.39)、(24.20±8.14)pg/mL，两组血清SDC-2、VEGF水平比较，P均<0.01。

2.2 RA、OA患者关节滑膜组织中SDC-2、VEGF表达比较 SDC-2、VEGF主要表达于血管内皮细胞胞质中，表现为棕黄色或棕褐色颗粒。RA患者关节滑膜组织中SDC-2结果为-者2例，+者2例，++者1例，阳性表达率为60%；VEGF结果为-者1例，+者2例，++者1例，+++者1例，阳性表达率为80%。而3例OA患者关节滑膜组织中SDC-2及VEGF结果均为-。与OA患者相比，SDC-2及VEGF在RA患者的关节滑膜组织中高表达(P均<0.01)。

2.3 RA患者血清中SDC-2、VEGF与CRP、ESR、RF、MCV、DSA28的相关性分析 RA患者中SDC-2、VEGF水平与CRP、ESR、关节压痛数、关节肿胀数、DSA28呈正相关(P均<0.01)，与RF、MCV无相关性。见表1。

表1 RA患者血清中SDC-2、VEGF与CRP、ESR、RF、MCV、DSA28的相关性分析

2.4 RA患者血清中SDC-2、VEGF的相关性 RA患者血清中SDC-2与VEGF呈正相关(r=0.498，P<0.01)。

3 讨论

VEGF能诱导内皮细胞增殖和迁移、细胞黏附，形成新血管，并增加血管通透性[7]，是RA血管新生中最有效的促血管生成因子[1]。据报道[2,3]，VEGF主要由滑膜衬里层细胞和巨噬细胞产生，其在RA的滑膜组织及血清中表达明显高于骨关节炎或其他形式的关节炎。在RA病程中，过量的促血管生成因子可促进滑膜炎症及骨和软骨破坏[8]。有实验证实[9]，敲除RA小鼠的VEGF基因后，其病理学改变及滑膜血管新生明显减轻。本研究结果表明，RA患者血清VEGF水平高于对照组，滑膜组织中VEGF表达高于OA患者，差异有统计学意义，提示VEGF与RA的发生发展有关。

多配体蛋白聚糖(SDC)属Ⅰ型跨膜蛋白，包括SDC1-4四种亚型，其中SDC-2主要由血管中的内皮细胞、周细胞和平滑肌细胞生成，能与不同的生长因子结合参与血管形成[6,10]。此外，SDC2下调可通过调节细胞的扩散、黏附和迁移影响血管内皮细胞形成毛细血管[11]。有研究证实，SDC-2在RA关节滑膜组织的血管内高度表达[6]。本研究中，RA患者血清SDC-2水平高于对照组，滑膜组织中SDC-2表达高于OA患者，差异有统计学意义，表明SDC-2参与了RA血管新生过程，与RA的发病及病情进展存在一定关系。

有实验证明[5]，脊椎动物中VEGF与SDC-2通过基因表达在血管生成中存在相互作用。本研究分析了RA患者血清SDC-2与VEGF 水平的相关性，发现两者间呈正相关。表明在RA发病过程中，VEGF和SDC-2可能呈协同作用。RA滑膜血管新生机制可能通过VEGF及SDC-2介导。目前对于SDC-2在血管生成过程中与生长因子相互作用的机制有以下设想:SDC-2的硫酸乙酰肝素链作为结合受体可直接与VEGF结合，从而调节VEGF在其受体附近的分布;SDC-2亦可作为共同受体，与VEGF及其受体形成信号复合物参与血管生成[5,12,13]，并影响RA进程。

本研究结果表明，血清SDC-2、VEGF水平与ESR、CRP、关节压痛数、关节肿胀数、DSA28评分等指标呈正相关,而与RF、MCV无相关性。Lee等[3]研究表明，VEGF水平不仅与ESR、CRP、关节压痛数、关节肿胀数呈正相关，且与RF呈正相关。研究间的差异可能是由于虽然RF可作为诊断RA的一个指标，但其与疾病活动的关系不大，且对于预测疾病预后的价值仍有异议[14]。ESR、CRP、关节压痛数、关节肿胀数、DSA28-CRP是判定疾病活动的指标，说明血清SDC-2、VEGF水平变化可作为临床观察RA病情活动的参考指标。

综上所述，SDC-2、VEGF在RA血清和关节滑膜组织中高表达，且二者呈正相关；二者可作为临床观察RA病情活动的参考指标。