酶法辅助优化平和蜜柚皮总黄酮的提取工艺研究*

谢勇武，谭属琼，张鹭文

（福建师范大学闽南科技学院，福建 泉州 362332）

蜜柚为芸香科柑橘属乔木，原产于中国福建，富含蛋白质、维生素等营养物质。平和蜜柚是琯溪蜜柚的一种，2007年被认定为中国驰名商标，2008年被认定为中国名牌农产品并被欧盟列为地理标志保护品种。黄酮类物质广泛存在于自然界的植物中，属植物次生代谢产物，许多水果皮中都含有丰富的黄酮类物质[1]。黄酮类物质产生的自由基存在于细胞膜的附近，是自由基猝灭剂和抗氧化剂[2-3]，可以起到抗癌、抗炎镇痛和防辐射的作用[4-6]。黄酮类化合物来自于天然植物，可用于食品中防止食品酸败氧化，延长食品保鲜期[7-9]，而生活中柚子皮除少量用来净化空气外大多数都当垃圾丢掉[10-11]。

本研究采用福建平和蜜柚皮为原料提取蜜柚皮总黄酮，研究提取的最佳工艺，提高产品附加值，为蜜柚皮加工提供参考依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

以福建平和县产蜜柚为原材料，选成熟度好、新鲜的柚子，取皮洗净晾干待用。

1.2 实验方法

1.2.1 蜜柚皮黄酮提取过程

平和蜜柚皮→切成碎片→80 ℃恒温干燥→粉碎

→过60目标准样筛→一定料液比加溶剂浸提→添加纤维素酶解→离心→比色计算提取率

1.2.2 绘制芦丁标准曲线

参照车京梅等[12]的方法进行标准曲线的绘制：精确称量在105 ℃鼓风干燥箱中烘干的芦丁标准品10 mg，置于洁净的烧杯中，加入体积分数为60%的乙醇使其充分溶解，然后全部转移到50 mL比色管中，定容至刻度，摇匀，即得到浓度为0.200 mg/mL的芦丁标准溶液。

分别移取上述芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于7支已编号的25 mL比色管中，分别加入浓度为5%的NaNO2溶液0.5 mL，摇匀经过6 min后，加入浓度为10%的Al(NO3)3溶液0.5 mL，再经过6 min后，加入浓度为4%的NaOH溶液5.0 mL，最后用浓度为60%的乙醇溶液定容至比色管的刻度线，摇晃至均匀，再静置15 min。以0号管作空白对照组，在510 nm波长处测吸光值，测3组数据后取平均值。以吸光度Y为纵坐标，浓度X为横坐标作图，得出芦丁浓度对吸光度的回归方程为：y=9.745x-0.0033，R2=0.9999，标准曲线如下图1所示：

图1 芦丁标准曲线

1.2.3 柚子皮中黄酮的提取率的计算

取1.0 mL提取液放置在25 mL的比色管中，加入0.5 mL的NaNO2溶液（浓度5%，质量分数），摇匀经过6 min后，加入0.5 mL的Al(NO3)3溶液（浓度10%，质量分数），再经过6 min后，加入5.0 mL的NaOH溶液（浓度4%，质量分数），最后用60%（体积分数）的乙醇溶液定容，摇晃至均匀，静置15 min测量吸光度。然后根据1.2.2中标准曲线方程计算提取液中蜜柚皮黄酮浓度，并按照如下公式计算蜜柚皮黄酮的提取率：

其中：C为黄酮的浓度，mg/mL；V为提取液的体积，mL；W为称取样品蜜柚皮粉的质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同纤维素酶用量对蜜柚皮中的黄酮总量提取率的影响

准确称取5份质量为1.000 g粉碎筛选后的蜜柚皮粉末，分别加入5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%的纤维素酶，加入蒸馏水进行调节使料液比为1∶20(g/mL)，接着放入温度为50 ℃的水浴锅处理1 h，在高速离心机（3000 r/min）离心15 min后准确量取1.0 mL上清液按照1.2.3的描述测定其提取率。结果如图2。

图2 纤维素酶用量对柚子皮中黄酮总量提取率的影响

图2曲线可以看出黄酮提取率先随纤维素酶用量提高而上升，之后再逐渐降低。在纤维素酶浓度为6.0%的时，黄酮提取率达到最高，为0.1722%。纤维素酶浓度在5.5%～6.0%的区间黄酮提取率是上升的，提取率在此区间提取率变化较大；纤维素酶用量在7.0%～7.5%这段区间表现为平滑的一段曲线，提取率变化不大；纤维素酶用量在6.0%～7.0%时黄酮提取率是下降的，变化较明显。所以，通过曲线可以得出纤维素酶浓度6%左右时达到了蜜柚皮黄酮总量提取率的最大值。

2.1.2 料液比对柚子皮中黄酮总量提取率的影响

准确称取5份质量为1.000g粉碎筛选过后的蜜柚皮粉末，加蒸馏水使料液比分别为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g/mL)，之后加入6%的纤维素酶，放入温度为50 ℃的水浴锅，50 ℃加热处理1 h之后在高速离心机（3000 r/min）离心15 min后准确量取上清液1.0 mL按1.2.3的描述测定其提取率。结果如图3。

图3 不同料液比对柚子皮中的黄酮总量提取率的影响

由图3可知，料液比在1∶20至1∶25的时候该曲线呈上升趋势，即蜜柚皮中的总黄酮提取率是逐渐升高，料液比为1:25左右总黄酮提取率达到最高值，原因可能是由于料液比的增加使料液与蜜柚皮充分反应进而升到最高；在料液比为1:25之后提取率是下降的，这可能是由于大量的杂质进入，稀释后导致提取率降低；在该曲线的1∶30至1∶40之间下降的较为平滑，可能是因为大容量的溶剂使溶质稀释导致无法发生反应从而浪费多余的料液，同时还相应地增加了实验误差。综上所述，料液比选定最佳参数为1∶25。

2.1.3 不同酶解温度比对柚子皮中黄酮总量提取率的影响

准确称取5份质量为1.000g粉碎筛选后的蜜柚皮粉末，加入6%的纤维素酶后加蒸馏水使料液比为1∶25，分别在温度40、45、50、55、60 ℃的水浴锅加热处理1 h，在高速离心机（3000 r/min）离心15 min后准确量取上清液1.0 mL，按1.2.3的描述测定其提取率。结果如图4。

图4 温度比对柚子皮中的黄酮量提取率的影响

由图4可以看出提取率随温度升高而提高，在55 ℃左右达到最高值，之后开始降低。曲线说明温度在55 ℃以下时温度提升促进酶与蜜柚皮的反应，温度为55 ℃的时候达到了反应的峰值；当温度从55 ℃升至60 ℃时，提取率反而降低则可能是温度过高使酶的分子结构被破坏而失活，导致提取率的逐渐下降。综上所述，酶解温度选定最佳参数为55 ℃。

2.1.4 不同时间比对柚子皮中黄酮总量提取率的影响

准确称取5份质量为1.000g粉碎筛选过的蜜柚皮粉末，加入6%的纤维素酶后加蒸馏水调整料液比为1∶25，在温度为55 ℃的水浴锅中分别处理30、60、90、120、150 min之后，在高速离心机（3000 r/min）离心15 min后准确量取上清液1.0mL，按1.2.3的描述测定其提取率。结果如图5。

图5 时间比对蜜柚皮中的黄酮量提取率的影响

表1 正交试验单因素水平表

由图5可知酶解时间在30 min到120 min总黄酮提取率随时间增加逐渐上升，120 min时提取率达到最高值，为0.4934%。从曲线可以看出，随着酶与蜜柚皮粉末酶解反应的进行总黄酮提取率逐渐升高，120 min之后总黄酮提取率降低可能是由于物料流失或者酶解时间过长、酶活性减弱等因素造成，需进一步研究。

综上所述，酶解时间选定最佳参数为120 min。

2.2 蜜柚皮总黄酮提取率的正交实验结果

通过对影响蜜柚皮提取率的4个变量（酶用量、料液比、酶解时间、酶解温度）的单因素试验结果的综合分析，设计L9(34)的正交实验。各单因素水平见表1，正交实验结果见表2。

据表2可知正交试验中总黄酮提取率最高的为6号工艺参数组合，但最优工艺参数组合是D2B3C3A3，而所列的正交表中并没有该组，故进行该组变量的验证实验。实验后测得该组工艺参数组合的黄酮提取率为0.514%，低于正交试验中的6号工艺参数组合得出的黄酮提取率。所以通过验证实验和正交实验得出的最优工艺参数组合为D2B3C1A2，即：6%酶用量、1∶30料液比、90 min酶解时间、50 ℃的酶解温度，得出最高黄酮提取率为0.546%。

各因素对平和蜜柚皮总黄酮提取率影响的主次顺序为：酶解温度＞料液比＞酶解时间＞酶用量。原因是处理的时间影响柚子皮黄酮提取，而长时间的酶解不会对黄酮提取有太大的帮助；温度对酶解效率会产生影响，酶解过程存在最适宜的温度，超过此温度会导致酶结构的破坏从而降低提取率，从正交试验结果分析看出酶解温度为影响最大的因素。

表2 正交试验结果与分析

3 结论

本研究将福建平和蜜柚皮为原料切片烘干粉碎过筛后用植物纤维素酶进行总黄酮提取，对提取工艺参数酶浓度、酶解时间、酶解温度、料液比进行单因素分析，得出正交实验各单因素水平值，并在单因素实验基础上进行正交实验和验证，最终得到的福建平和蜜柚皮总黄酮的最佳提取工艺条件为：纤维素酶6%，料液比1∶30，酶解温度50 ℃， 酶解时间90 min，得到的总黄酮提取率为0.546%。本研究可以为今后蜜柚皮的加工处理提供新的参考，从而提高产品附加值。