药品微生物控制中水分活度测定的应用前景*

杨晓莉，李 辉 ，许华玉 ，王似锦，绳金房

（1．陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710065； 2．国家药典委员会，北京 100061；3．中国食品药品检定研究院，北京 100050）

水分活度(aw）是评价食品和化妆品微生物风险和产品稳定性的重要依据，但在制药工业中使用水分含量反映药品质量安全和稳定还是一个相对较新的概念[1]。aw与微生物的生长密切相关，而微生物指标是反映药品安全性和有效性的重要指标，通过测定aw可更好地反映药品质量[2]。2015年版《中国药典》整合了先进理念，借鉴了国外药典的先进技术和经验，兼顾国情对非无菌制剂微生物限度检查法等内容做了较大修订[3]，但在非无菌制剂微生物控制相关指导原则方面还不完善，仅收载了水分测定方法[4]，尚未收载aw测定在非无菌制剂中的应用指导原则，仍与《美国药典》(USP）存在一定差距[5]，这一现状与我国《药品生产质量管理规范》（GMP）强调的药品源头控制和过程控制要求不相适应[6]。因此，亟需制订相应的指导原则，以提高药品微生物污染的源头控制和过程控制的可操作性和有效性。

1 概述

1953年，澳大利亚食品微生物学家Scott[7]研究了30℃下金黄葡萄球菌与aw的关系，发现其生长有最低的aw限值，低于该值微生物就不能生长，首次提出了aw的概念[7]。随后，Christian等[8]研究沙门菌的生长与aw的关系，发现了类似规律。1957年，Scott[9]对引起食品腐败的微生物与aw的关系进行了全面论述，发现是aw而不是水分含量决定微生物赖以生存的自由水的多少。之后，aw与微生物的关系便成为微生物科学家研究的热门领域[10-13]。1978年，德国食品微生物学家L．Leistner研究了影响微生物生长的各种因素，提出了栅栏理论，认为aw是影响微生物生长的重要栅栏因子之一，aw与其他栅栏因子协同作用，应用于食品的保存[14]。2006 年，USP 29-NF24<1112>首次收载aw测定[15]应用于非无菌制剂微生物控制的章节，将其成功引入制药工业药品微生物控制[15]。

aw是相同温度下产品水蒸气压(P）与纯水蒸气压(Po）的比值。其在数值上等于封闭系统中由产品产生的相对湿度（RH）的1/100。RH可通过直接测量蒸气分压或露点的方法获得，也可通过传感器间接测量[5]。aw和平衡相对湿度（ERH）的计算关系为ERH(%）=aw×100%。

2 水分活度与微生物控制原理

2.1 微生物生长的最低 aw

微生物生长环境中可利用的水分是其生长的必要条件，而aw表示产品中水的一种能量状态[16]，反映水与产品组分之间结合的紧密程度，是微生物赖以生存的自由水的量度。aw介于0～1。数值越大，表示水的自由程度越高，越容易被微生物利用；数值越小，表示水的自由程度越低，水与产品组分之间结合得越紧密越难被微生物利用。aw与微生物的生长密切相关，在控制微生物生长繁殖方面起着重要作用。

通常物质中的水被分为自由水（或游离水）和结合水。微生物需要自由水进行新陈代谢活动，如细菌细胞只能通过细胞壁传递营养物质和代谢产物，代谢产物必须是可溶形式以渗透细胞壁[17]。当微生物细胞处于低aw时，由于渗透作用，水倾向于流出细胞，如果细胞无法调节水的平衡，细胞生长将会被抑制甚至死亡[18]。而aw是“自由水”的量度，因此用于反映微生物的生长繁殖，aw是比水分含量更有效的参数。微生物的生长活动只发生在一定aw范围内，其生长都有最低限值，低于了这个限值微生物就不能生长。不同微生物生长的最低aw需求不同。一般来说，革兰阴性菌包括与药品质量密切相关的控制菌，如铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌等在aw低于0．91的产品中不会生长繁殖，革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌在aw低于0．86不会生长繁殖，黑曲霉在aw0．77以下不会生长繁殖，所有微生物在aw低于 0．60时不会增殖[5]。

产品中的aw降低意味着微生物可利用的自由水减少，微生物的新陈代谢困难。许多微生物通过细胞调节可在低aw条件下存活，但不能生长。随着aw的降低将导致微生物生长停滞期的延长，生长速率减慢和菌落数量减少[16]，图1显示了不同aw对金黄色葡萄球菌生长曲线和最大菌落数量的影响[19]。产品中细菌、酵母菌和霉菌的萌发、新陈代谢、繁殖和生存需要可利用水，基于这样的规律，可利用aw这一重要参数预测产品中潜在微生物生长繁殖的能力和潜在的安全风险。

图1 不同 aw对金黄色葡萄球菌生长曲线和最大菌落数量的影响

2.2 aw是微生物生长的栅栏因子

aw的研究源于食品，在食品中的应用也较为成熟。栅栏技术认为aw是诸多影响微生物生长的重要栅栏因子之一。栅栏技术把高温、低温、控制aw、调节pH、采用辐照、控制氧化-还原电位、添加抑菌剂等归纳成单独栅栏因子，并提出食品防腐就是调控这些因子，打破微生物内平衡，从而限制微生物的生长繁殖[14]。这些因子相互作用形成了特殊的防止食品腐败变质的栅栏，对食品的防腐保持联合作用及栅栏效应。栅栏因子间的相互作用及与食品中微生物的相互作用的结果，不仅是这些因子单独效应的简单累加，而且也是协同作用，这种效应称作栅栏效应（hurdle effect）[20-21]。控制aw，对于中等含水量和高含水量食品保藏具有重大意义。在食品储藏中，初始载荷微生物应当不能克服最初的栅栏因子，否则食品就会腐败变质，甚至引发食物中毒。通过栅栏技术使食品本身具有一定的抑菌能力，可以使食品的微生物特性稳定，使得储藏的食品更安全[22]。

栅栏技术应用于食品保存的6个案例[23]（图2）可帮助理解aw对于微生物生长的重要意义。栅栏因子的组合将增加不利于食品中潜在微生物的生长，并增加微生物生长的滞后期，如果微生物的生存环境持续抑制其生长繁殖，滞后期无限延长，将致使微生物死亡[24]。

图2 6个食品保存案例栅栏效应分析

3 aw在药品微生物控制中的应用现状

相比药品，食品中富含丰富的营养成分，更适合微生物的生长繁殖，aw在食品工业中的成功应用，为非无菌制剂的微生物控制提供了值得借鉴的新方法。USP<1112>中提到的“水分活度的测定在非无菌制剂中的应用”，为非无菌制剂的微生物控制提供了一个有力的应用指导原则。相比微生物限度检查，aw测定可以更快[25]、更准确地预测微生物对产品稳定性和安全性的影响。同时，aw也和产品的化学和物理稳定性有直接关系。通过对药品aw的测定和分析，不但可筛选出更合理的处方，同时还能预测药品潜在的微生物风险。

然而，aw测定在药品微生物控制中的应用还是一个较新的领域，通过其可以反映药品潜在微生物生长状况及评估安全风险，近年来逐渐受到重视。一些制药公司已利用aw控制微生物生长的理念开发新药，可节省成本，优化微生物限度检查方案。如美国辉瑞制药有限公司应用aw预测生产过程中溶液中微生物的生长或抑制，创建溶液类型，以确定溶液的有效期，节省时间-费用成本[26]。葛兰素史克公司在新药开发时，将aw作为稳定性计划的一部分进行测试，以确保包装产品在特定储存温度和湿度下的质量稳定，满足安全性标准和有效期要求[27]，为研发和商业应用提供优化的微生物限度检查和抑菌效力检查测试计划节省大量资源和成本，提高了效率[28]。

目前，制药企业存在对药品过度防护和依赖终端检验的情况，微生物污染风险管理水平较薄弱，过程控制手段缺失。aw是影响微生物生长的关键因素，影响着药品的安全性和有效性，对其测定是进行药品生产的过程控制和参数放行的必要手段，值得深入研究和应用。

4 aw在药品微生物控制中的应用前景

在制药工业中，非无菌制剂aw与以下方面有关：1）药品处方及抑菌体系的抑菌有效性；2）药品处方中易于化学水解的活性药物成分的降解；3）药品处方(尤其是液体、膏、乳液和霜）易受微生物污染的程度；4）提供了减少微生物限度检查，依照通则非无菌制剂微生物限度检查法筛查药品有效性、稳定性和控制菌释放的理论依据[5]。不同aw药品中的微生物生存行为对于药品微生物控制非常重要，低aw会防止微生物在药品上的生长繁殖。在科学的微生物风险评估基础上，可根据aw设置有针对性的个性化微生物控制方案，如全面的微生物限度检查或减少日常检查。应注意的是，使用aw进行微生物控制，必须遵循严格的GMP，以确保微生物的最低负荷。USP<1112>提供了药品处方对微生物污染影响的指导，降低药品aw对预防潜在微生物的增殖大有裨益；非无菌制剂的处方，生产步骤和测试应反映这一参数。

当前符合GMP生产要求的药品aw较低，没有或几乎没有微生物污染的风险，在此情况下，日常进行的微生物限度检查没有必要。由于非水性液体制剂或固体药剂为低aw，不支持孢子萌发和微生物生长，其微生物监控频率决定于产品的历史测试数据和原料、水、生产过程的微生物污染控制的有效性证明[28]。在科学的微生物风险评估基础上，采用aw测定进行微生物监控，建立合理的微生物控制策略、设计性能优良的药品对于节约成本、提高效率、提升产品质量具有重要指导意义。

国际人用药品标准协调组织（ICH）Q6A的决策树6#原料药和辅料的微生物检查（图3）和8#非无菌药品的微生物检查（图4）[29-30]，是低aw的非无菌原料药和辅料及非无菌制剂可不进行批批微生物限度检查的重要技术指导原则[28]。我国于2017年正式加入ICH，意味着中国的药品监管部门、制药行业和研发机构将逐步转化和实施国际科学技术标准和指南，并积极参与规则制订，将推动国际创新药品早日进入中国市场，满足临床用药需求，同时提升国内制药产业创新能力和国际竞争力[31]。在新形势下研究国外药品微生物控制方面的先进经验，对于优化产业升级、节约资源及逐步提高我国药品的国际竞争力具有现实意义。应用aw控制药品生产过程的微生物生长是微生物控制发展的必然趋势。应重视aw在药品研发阶段参与处方筛选，评估药品的微生物风险，设计出低微生物风险的药品，不是依赖检验进行药品的微生物控制，而是质量源于设计（QbD）理念的必然要求。然而，我国药品领域尚未建立aw测定的标准方法，利用aw控制微生物生长的应用仍为空白。因此，亟待制订符合国情和发展需要的非无菌制剂aw的测定应用指导原则，以推动我国药品微生物控制的发展。

图3 ICH Q6A决策树6#（原料药和辅料的微生物检查）

图4 ICH Q6A决策树8#（非无菌药品的微生物检查）