沉默E盒锌指结合蛋白1对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响

高学忠 袁惠玲 吴丽华

(东莞市人民医院乳腺科，广东 东莞 523000)

乳腺癌发生于乳腺上皮组织，是一种主要发生于女性的恶性肿瘤，乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，加上乳腺癌具有早期症状不明显、发展速度快等特点〔1，2〕。乳腺癌的发生同基因的异常表达有关，这些异常表达的基因能够通过影响乳腺癌细胞的多种生物学特性影响肿瘤的发生〔3〕。E盒锌指结合蛋白(ZEB)1是一种锌指类蛋白转录的调控因子，最初在鼠的肢体、脊髓等组织中发现，其表达异常后可以引起较为严重的胚胎畸形〔4，5〕。ZEB1在肿瘤组织中的表达水平普遍较高，并且与肿瘤的恶性程度有关，之前的研究报道显示，ZEB1沉默具有抑制结肠癌、肝癌等细胞增殖并诱导凋亡的作用，而对于沉默ZEB1在乳腺癌细胞增殖凋亡中的作用尚不明确〔6，7〕。本研究用乳腺癌细胞作为研究对象，通过siRNA下调乳腺癌细胞中ZEB1的表达，探讨沉默ZEB1对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料 乳腺癌细胞MDA-MB-231购自美国ATCC；慢病毒LV-ZEB1-siRNA和LV-siRNA control由吉满生物科技(上海)有限公司构建；RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；cDNA合成试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；ZEB1抗体、激活型Caspase-3(酶切Caspase-3)抗体、细胞周期素(cyclin)E抗体均购自美国CTS；p27抗体、细胞色素(Cytochrome)C抗体均购自美国Abcam；胞质蛋白提取试剂盒、线粒体蛋白提取试剂盒均购自美国Thermo。

1.2细胞分组 MDA-MB-231细胞培养至对数期以后，接种到12孔细胞培养板内，细胞培养液密度为1×105个/ml，细胞汇合度为40%时，进行慢病毒感染。用含有455 μl培养基、100 μg/ml的polybrene、1×108TU/ml的病毒液20 μl均匀混合后，添加到用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后的上述细胞中，感染后10 h进行换液，培养3 d后，观察荧光表达情况，感染效率高于90%，用于后续实验。把感染慢病毒LV-ZEB1-siRNA和LV-siRNA control的细胞分为ZEB1 siRNA组和siRNA control组，把没有感染的细胞作为Control组。取上述细胞，以荧光定量PCR和Western印迹检测沉默效果。

1.3荧光定量PCR检测沉默效果 Control组、siRNA control组、ZEB1 siRNA组细胞按照每107个细胞加入1 ml的Trizol溶液裂解细胞以后，按照常规方法提取细胞中的总RNA，RNA用无RNase的水溶解后，置于-80℃保存。移液枪吸取2 μl RNA样品，以紫外分光光度计测定A260/A280的比值在1.8～2.0之间。每组样品吸取2 μg的RNA，反转录合成cDNA，步骤同cDNA合成试剂盒，cDNA保存在-20℃。取各组cDNA，进行荧光定量PCR反应，配制25 μl体系，包含cDNA 1 μl、1 μl的10 μmol/L上下游引物、12.5 μl的2×SYBR Green Supermix。PCR仪程序为：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环。β-actin作为内参，以Step One分析扩增产物的Ct值，计算ZEB1水平。引物如下：β-actin-上游引物5′-GAGGAGGAGGAGAAGGAAT-3′，下游引物5′-AGCCAGTAGTAGCCAACA-3′。ZEB1上游引物5′-GGCAGAGAATGAGGGAGAAG-3′，下游引物5′-CTTCAGACACTTGCTCACTACTC-3′。

1.4Western印迹检测沉默效果 Control组、siRNA control组、ZEB1 siRNA组细胞中加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，放在冰上充分裂解约30 min，收集上清，用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒对蛋白定量。将蛋白同十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上样缓冲液在100℃孵育5 min后，在每个上样孔中加入20 μg的蛋白样品。蛋白凝胶用10%分离胶和5%的浓缩胶进行电泳，蛋白样品在浓缩胶中以70 V电压进行电泳，以100 V电压在分离胶中电泳，肉眼观察染料跑出凝胶之后终止电泳。取出凝胶，进行转膜。转膜条件为：100 mA，4℃，此时蛋白从凝胶转移至NC膜上。取NC膜，进行抗体孵育，NC膜置于含有5%牛血清白蛋白封闭液的平皿中，置于室温条件下孵育1 h，再将NC膜置于含有1∶800稀释的抗ZEB1抗体中，在4℃中结合反应12 h，再同辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶3 000稀释)置于室温中结合孵育2 h。电化学发光(ECL)法发光以后，曝光。对各蛋白条带进行灰度值扫描，β-actin为参照，用各组目的条带的灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白水平。

1.5MTT法检测细胞增殖能力 Control组、siRNA control组、ZEB1 siRNA组细胞接种到96孔板，分别在培养1 d、2 d、3 d、4 d后各取出一个培养板，进行MTT检测。MTT方法为：按照每个孔内加入20 μl的MTT，放在37℃的培养箱中孵育结合4 h，把培养板取出后，按照每个孔中加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO)，在震荡仪上反应10 min，再放置于酶标仪上，检测波长490 nm的A值，用不加入细胞的孔调零。

1.6流式细胞术检测细胞周期 Control组、siRNA control组、ZEB1 siRNA组细胞以0.25%的胰酶消化后，用PBS洗涤，加入用PBS配制的75%的乙醇，放在4℃条件中孵育过夜。收集细胞，加入RNaseA酶，添加50 μg/ml的PI染液，混合后，放在4℃孵育结合，300目滤网过滤以后，流式细胞仪检测细胞周期变化。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡 Control组、siRNA control组、ZEB1 siRNA组细胞以0.25%的胰酶消化后，制成单细胞悬浮液，细胞密度为每毫升含有106个细胞，1 000 r/min离心10 min，用PBS将细胞沉淀悬浮洗涤2次，加入200 μl的Annexin V-FITC结合缓冲液将细胞悬浮，分别添加各5 μl的Annexin V-FITC和PI染液，以流式细胞仪测定每组乳腺癌细胞的凋亡情况。

1.8Western印迹检测细胞中酶切Caspase-3、cyclin E、p27和线粒体、胞质中CytochromeC蛋白水平 Control组、siRNA control组、ZEB1 siRNA组细胞按照1.4中Western印迹方法检测细胞中酶切Caspase-3、cyclin E、p27蛋白水平，同时以Western印迹方法检测线粒体、胞质中CytochromeC蛋白水平，线粒体和胞质蛋白提取参照线粒体、胞质蛋白提取试剂盒。酶切Caspase-3、cyclin E、p27蛋白表达水平以β-actin作为参照，线粒体中CytochromeC蛋白水平以VDAC1为内参，胞质中CytochromeC蛋白水平以β-actin为内参。

1.9统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析及SNK-q检验。

2 结 果

2.1成功构建沉默ZEB1的乳腺癌细胞 如图1和表1中所示，乳腺癌细胞感染慢病毒LV-ZEB1-siRNA后，细胞中ZEB1 mRNA和蛋白表达水平均明显降低，说明构建了沉默ZEB1的乳腺癌细胞，为后续研究提供了条件。

2.2沉默ZEB1可明显降低乳腺癌细胞增殖能力 表2所示，沉默ZEB1后的乳腺癌细胞A490值明显降低，提示沉默ZEB1可以下调乳腺癌细胞的增殖能力。

图1 Western印迹测定稳定感染慢病毒LV-ZEB1-siRNA后细胞中ZEB1蛋白水平

表1 乳腺癌细胞中ZEB1 mRNA和蛋白表达水平变化

与Control组比较：1)P<0.05，下表同

表2 沉默ZEB1后的乳腺癌细胞A490值变化

图2 Western印迹检测沉默ZEB1后的乳腺癌细胞中cyclinE、p27蛋白水平

2.3沉默ZEB1可阻碍乳腺癌细胞从G0/G1向S期进展 如图2和表3中所示，沉默ZEB1后的乳腺癌细胞G0/G1期细胞比例明显升高，同时细胞中cyclinE蛋白水平降低，p27蛋白水平升高，说明沉默ZEB1可以诱导乳腺癌细胞周期阻滞。

表3 沉默ZEB1后的乳腺癌细胞周期分布和cyclinE、p27蛋白水平变化

2.4沉默ZEB1可明显促进乳腺癌细胞凋亡 如图3和表4中所示，沉默ZEB1后的乳腺癌细胞凋亡率明显升高，同时细胞中酶切Caspase-3蛋白水平升高，说明沉默ZEB1可以诱导乳腺癌细胞凋亡发生。

2.5沉默ZEB1促进乳腺癌细胞线粒体释放CytochromeC 如图4和表5中所示，沉默ZEB1后的乳腺癌细胞胞质中CytochromeC水平明显升高，线粒体中CytochromeC水平明显降低，说明沉默ZEB1可以促进乳腺癌细胞线粒体释放CytochromeC。

图3 Western印迹测定沉默ZEB1后乳腺癌细胞中酶切Caspase-3蛋白水平

表4 沉默ZEB1后的乳腺癌细胞凋亡率和酶切Caspase-3蛋白水平变化

图4 Western印迹检测沉默ZEB1的乳腺癌细胞线粒体和胞质中CytochromeC蛋白变化

表5 沉默ZEB1后的乳腺癌细胞线粒体和胞质中CytochromeC蛋白变化

3 讨 论

ZEB1是具有抑制IL-2表达作用的锌指结构蛋白，其基因定位在10p11.2染色体上在，含有多个剪切变异体，其含有两个相邻的锌指簇，这两个锌指簇能够特异性地同CACCT序列、CAGGTG序列结合，调控靶基因的转录〔8，9〕。两个锌指簇中间含有的结构域不参与DNA的结合，能够与其他相关调节因子结合影响ZEB1功能发挥，另外ZEB1含有CID结构域，能够与CtBP结合，促进染色质的凝聚，影响靶分子的转录〔10，11〕。ZEB1在成人的膀胱、子宫等中高表达，在胎儿的心脏、肺脏、甲状腺中也具有较高水平的表达，ZEB1与肿瘤发生有关，其在胆囊癌、胰腺癌等肿瘤组织中表达水平较高，并且沉默ZEB1表达后可以发挥抑制肿瘤的作用〔12，13〕。目前在膀胱癌、结肠癌等肿瘤细胞中发现ZEB1表达下调可以抑制肿瘤细胞的生长、侵袭、迁移，同时还具有诱导细胞凋亡的作用〔14，15〕。在乳腺癌中的研究显示，ZEB1下调可以抑制乳腺癌细胞的转移潜能〔16〕。本实验的结果显示，沉默ZEB1后的乳腺癌细胞增殖能力降低，细胞凋亡水平升高，说明沉默ZEB1具有抑制乳腺癌细胞生长诱导乳腺癌细胞凋亡的作用，这明确了ZEB1在乳腺癌细胞增殖凋亡中的作用，说明沉默ZEB1具有抗乳腺癌细胞的作用。

细胞周期是生命活动的基础，细胞在细胞周期时相变化中发生增殖、分化、衰老等状态，细胞周期主要分为G1期、S期、G2期和M期，细胞周期蛋白一共含有8个亚型，分别在不同的周期变化时呈现规律性的表达，其中cyclinE是哺乳动物中G1期调控蛋白，在G1期的晚期表达水平最高，能够促进细胞进入S期，cyclin E是细胞周期进展的促进因子〔17～19〕。p27是细胞周期抑制蛋白，其可以通过末端的Thr位点阻碍周期蛋白功能发挥，高表达p27能够使细胞停滞在G1期〔20〕。研究显示，ZEB1敲减可以将脂肪间充质干细胞周期阻滞在G1期，抑制细胞增殖能力，后续在胰腺癌、大肠癌中的研究显示，ZEB1敲减可能通过阻滞G1期进展降低癌细胞增殖能力〔21～23〕。本实验表明，沉默ZEB1后的乳腺癌细胞G1期比例升高，细胞中cyclin E蛋白水平降低，p27蛋白水平升高，说明沉默ZEB1可以将乳腺癌细胞阻滞在G1期。

细胞凋亡机制较为复杂，其中包括线粒体途径、内质网途径、死亡受体途径等，线粒体途径是发现较早的一种凋亡发生机制，其发生的关键是线粒体内CytochromeC的释放，正常情况下，CytochromeC主要存在于线粒体内，在受到外界因素的刺激以后，线粒体中的CytochromeC进入到胞质内，激活下游Caspase级联反应，诱导细胞凋亡发生，CytochromeC进入胞质是线粒体凋亡途径发生的关键因素〔24～26〕。本实验的结果显示，沉默ZEB1可以促进线粒体中CytochromeC进入胞质，诱导细胞中凋亡执行因子Caspase-3的活化，诱导细胞凋亡发生，这提示沉默ZEB1可以通过线粒体途径诱导乳腺癌细胞凋亡。

总之，沉默ZEB1具有抗乳腺癌的作用，其可以抑制乳腺癌细胞的生长，阻滞乳腺癌细胞周期，诱导乳腺癌细胞凋亡，这为以后研究ZEB1在乳腺癌发生中的作用奠定了基础，为基因靶向治疗乳腺癌提供了思路。