分枝杆菌双相罗氏培养基在结核病诊断中的应用研究

宋媛媛 刘二勇 陶波山 黄费湘 肖亚利 蓝如束 谭云洪 李辉 叶磊 成诗明 赵雁林

结核病细菌学诊断的“金标准”是培养法，其既是结核病最可靠的检测方法，也是获得阳性培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验(简称“药敏试验”)及分子生物学检测研究的基础。目前，公认的结核分枝杆菌培养方法有2种，即快速液体培养法和固体罗氏培养法。快速液体培养法检测结果报告的时间快，阳性结果报告时间一般为10～20 d，阴性结果报告时间为42 d，但其价格昂贵，需要特殊仪器，在基层医疗卫生机构使用受到一定的限制。固体罗氏培养法是传统的培养方法，也是我国普遍应用的分枝杆菌培养方法，报告结果的时间较长，一般阳性结果报告时间为20～30 d，阴性结果报告时间为56 d。其价格低廉，能在县(区)级基层医疗卫生机构使用。

分枝杆菌双相罗氏培养基(简称“双相培养基”)是一种能促进分枝杆菌快速生长的新型培养基，阴性结果报告时间为42 d。其结合了改良罗氏培养基和液体培养基的优点，分枝杆菌可在培养基的固体斜面上形成典型的菌落，同时又因为含有显色剂，在液体培养基中呈现粉红色或红色颗粒状生长。为探讨该培养基在基层实验室推广应用的可行性，笔者选取我国3个省的3个地市级结核病诊疗机构，采用多中心试验方法评价该培养基在结核病诊断中的价值。

材料和方法

1.研究对象：连续纳入2014年10月至2015年10月在广西壮族自治区北海市结核病防治院、湖南省邵阳市结核病防治医院、河南省南阳市第六人民医院就诊的初诊肺结核可疑症状者作为研究对象，共计2320例。其中，肺结核患者1176例，非肺结核患者1144例；其中，男1536例(66.21%)，女784例(33.79%)；最小年龄10岁，最大年龄104岁，年龄中位数(四分位数)[M(Q1,Q3)]为50(33, 63)岁；其中15例因分枝杆菌改良罗氏培养基(简称“罗氏培养基”)和双相培养基中的1种或2种培养污染或结果缺失，故在两种培养基检测结果进行比较时不计入分析。由接受过培训的临床医生询问研究对象的基本信息、本次就诊症状及病史，并结合细菌学检查和X线胸部摄影(简称“胸片”)结果，参考《WS 288—2008 肺结核诊断标准》[1]诊断肺结核患者。每例患者均有胸片，并均留取3份痰标本(即时痰、夜间痰、晨痰)进行萋-尼染色法涂片镜检(简称“涂片”)，并选取2份性状好的痰标本同时进行罗氏培养基培养、双相培养基培养。

2.试剂及培养基：萋-尼染色液购自珠海贝索生物技术有限公司。罗氏培养基购自河南省赛诺特生物技术有限公司，由7 ml改良罗氏培养基组成，阴性结果观察至第8周报告。双相培养基购自珠海市银科医学工程股份有限公司，由固体和液体两部分组成；固体部分含有7 ml国内外通用的改良罗氏培养基成分，液体部分由3 ml基础培养基、促生长剂、抑菌剂和显色剂组成；阴性结果观察至第6周报告。

3.涂片镜检：萋-尼染色法涂片镜检遵照《痰涂片显微镜检查标准化操作及质量保证手册》[2]中的标准化操作程序执行。

4.痰标本前处理方法及培养：采用中和离心法对同一份痰标本进行去污染处理，分别接种0.1～0.15 ml在罗氏培养基和双相培养基上进行培养，遵照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[3]中的标准化操作程序执行。

5.质量保证：(1)制定项目实验室标准化操作程序手册及质量保证手册。(2)研究人员统一经过培训合格。(3)国家级和省级疾控中心(结核病防治所)对项目点每3个月进行1次督导。(4)每月进行数据统计分析，包括标本量、阳性率、涂阳培阳率、涂阳培阴率、污染率。

6.统计学处理：使用SPSS 24.0软件，采用配对χ2检验比较两种培养基的阳性检出率，以P<0.05为差异有统计学意义；分别以罗氏培养基培养结果、临床诊断为标准对双相培养基的检测效能进行评价；采用Wilcoxon秩和检验对罗氏培养基与双相培养基检出时间的差异进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.阳性检出率：在初诊肺结核可疑症状者中，涂片阳性率为15.30%(355/2320)； 罗氏培养基和双相培养基两种培养方法阳性检出率分别为19.65%(453/2305)和22.00%(507/2305)，后者较前者高2.34%，差异有统计学意义(χ2=22.091，P=0.000)。在临床诊断的肺结核患者中，涂片阳性率为30.19%(355/1176)；涂片加罗氏培养基培养阳性率为43.11%(507/1176)；涂片加双相培养基培养阳性率为46.34%(545/1176)。

2.以罗氏培养基培养结果为标准对双相培养基检测效能的评价：双相培养基的敏感度为91.39%(414/453)，特异度为94.98%(1759/1852)，一致率为94.27%(2173/2305)(表1)。假阴性率为8.61%(39/453)，假阳性率为5.02%(93/1852)。在双相培养基检测出现假阴性的39例患者中，有24例涂片结果为阴性，8例涂片结果为1～8条/300个视野或+；有15例罗氏培养基培养结果为实际菌落数，13例罗氏培养基培养结果为+；在双相培养基检测出现假阳性的93例患者中，双相培养基培养结果均为实际菌落数。

3.以临床诊断为标准评价罗氏培养基和双相培养基的诊断价值：罗氏培养基诊断肺结核患者时ROC曲线下面积为0.694(95%CI：0.672～0.715)，与完全无价值的诊断试验曲线下面积0.5相比较差异有统计学意义(Z=17.636,P=0.000),诊断价值较低。双相培养基诊断肺结核患者时ROC曲线下面积为0.707(95%CI：0.685～0.728)，与完全无价值的诊断试验曲线下面积0.5相比较差异有统计学意义(Z=18.818,P=0.000),诊断价值中等。对两种培养基的曲线下面积进行比较，差异无统计学意义(Z=0.836，P=0.403)(图1)。

图1 以临床诊断为标准，罗氏培养基和双相培养基诊断肺结核患者的ROC曲线

4.罗氏培养基与双相培养基报阳时间分析：罗氏培养基报阳时间中位数(四分位数)[M(Q1,Q3)]为28(21,34) d，双相培养基报阳时间M(Q1,Q3)为18(14,24) d，双相培养基比罗氏培养基报阳时间明显缩短，差异有统计学意义(Z=15.114，P=0.000)。不同涂片结果使用双相培养基较罗氏培养基报阳时间均明显缩短，差异均有统计学意义(表2)。

表1 以罗氏培养基培养结果为标准对双相培养基检测效能的评价

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；一致率=(真阳性例数+真阴性例数)/总例数×100%

表2 不同涂片结果使用罗氏培养基和双相培养基报阳时间比较

讨 论

在结核病防治工作中快速诊断结核病至关重要，诊断结核病的金标准是培养法。据文献报道双相培养基、加入不同营养物的固体培养基、各类液体培养基与罗氏培养基培养结果相比，阳性检出率提高分别在0.8%～7.2%[4-6]、1.6%～7.1%[7-9]、0.4%～7.5%[10-14]之间。本研究双相培养基较罗氏培养基阳性检出率提高2.34%，与文献报道相符。双相培养基液体部分可达到快速培养的目的，固体部分可提供分枝杆菌典型菌落，体现了双相培养基的优点[15]；一般的液体培养基阳性菌落呈白色颗粒状，难以鉴别菌落特性[5]，本研究的双相培养基在液体培养基中加入了显色剂，实验员可通过肉眼观察双相培养基变色情况判断是否有分枝杆菌生长。

本研究显示双相培养基的敏感度为91.39%，特异度为94.98%。据文献报道[16-20]，双相培养基、加入不同营养物的固体培养基、各类液体培养基的敏感度在67.3%～98.3%、特异度在84.4%～100%，本研究结果在文献报道范围内，且敏感度、特异度较高。双相培养基与罗氏培养基培养结果的一致率为94.27%，假阴性率为8.61%，假阳性率为5.02%。在双相培养基检测出现假阴性的39例患者中，有24例涂片结果为阴性，8例涂片结果为1～8条/300个视野或+；有15例罗氏培养基培养结果为实际菌落数，13例罗氏培养基培养结果为+，由此得出尽管罗氏培养基检出阳性，但阳性级别较低，而且多数是仅为其中1份痰标本检出阳性，且涂片结果大多为阴性，因此双相培养基没能检出也存在较大可能。出现假阳性的原因主要是双相培养基诊断价值较高，检出了罗氏培养基没有检出的一部分患者。出现假阳性的93例患者中，双相培养基培养结果均为实际菌落数，这说明双相培养基在培养含菌量极低的痰标本时具有更高的阳性检出率。尽管两种培养基的ROC曲线下面积不是太高，主要因为比较对象是临床诊断。结核病的临床诊断主要依据临床症状和体征，结核分枝杆菌病原学、病理学、影像学等检查的证据[21]。虽然细菌学诊断是结核病诊断的“金标准”，但痰涂片的阳性检出率较低，痰培养虽可提高阳性检出率，但也不足50%[22]。根据2018年全球结核病报告，我国2017年活动性肺结核患者病原学阳性率为32%[23]。《“十三五”全国结核病防治规划》[24]中提出肺结核患者病原学阳性率需达到50%以上。本研究在活动性肺结核患者中，涂片阳性率为30.19%，涂片加罗氏培养基培养阳性率为43.11%，涂片加双相培养基培养阳性率为46.34%，使用双相培养基培养阳性率已经更接近50%的目标，也提示需要采取结核分枝杆菌核酸检测来进一步提高病原学阳性率。

双相培养基较罗氏培养基报阳时间缩短10 d，略高于文献报道的缩短6～9.3 d[10,25-27]。而且在不同阳性级别的痰标本中也表现出更短的报阳时间，差异均有统计学意义。随着涂片阳性级别升高，双相培养报阳时间随之更短，报阳时间与标本中的活菌量有关, 活菌量越大, 平均报阳时间越短[28]。本研究证实了这一结论。

双相培养基较罗氏培养基具有更高的阳性检出率，诊断价值较高，报阳时间明显缩短，是一种可以作为结核病临床诊断的参考方法，在我国基层实验室有一定推广应用价值。

志谢湖南省邵阳市结核病防治医院、广西壮族自治区北海市结核病防治院、河南省南阳市第六人民医院工作人员在研究现场所付出的努力与辛勤工作！