茶树CsASMT基因的克隆和表达分析

师 聪, 师环环, 刘恩岐，刘 辉，秦 杰

(1 徐州工程学院 食品(生物)工程学院，江苏徐州 221018；2 徐州工程学院 化学化工学院，江苏徐州 221018)

褪黑素(melatonin, MT)是大脑里“松果体腺” 分泌的一种荷尔蒙，生命必需的吲哚胺类物质[1-2]。在1995年，褪黑素被发现存在于各种植物中。在植物体中，褪黑素具有很强的抗氧化性，可以大量清除活性氧和活性氮。同时它还起着信号分子的作用[3-5]，可以诱导或抑制与信号传导[6]、细胞生长[7]、衰老[8]和叶绿素降解[9]相关的基因，进而影响植物生理功能。此外，褪黑素通过提高防御相关酶的活性来提高植物的抗病性[10]。由于褪黑素的生理功能，植物已经形成了与褪黑素合成相关的复杂系统，来响应各种环境刺激如温度[11-12]、水胁迫[11-13]、光照强度[14-15]以及内源性信号分子乙烯和脱落酸[12]。

高等植物中褪黑素的合成是由芳香族氨基酸色氨酸经4种酶连续反应生成，随着越来越多对褪黑素的研究，催化合成褪黑素途径相关编码酶的基因被克隆。其中N-乙酰基-5-羟色胺甲基转移酶(ASMT)是褪黑素的合成途径的关键酶。ASMT可以催化N-乙酰基-5-羟色胺(N-acetylserotonin)生成褪黑素，当5-羟色胺转化成褪黑素急剧减少时，这步反应是最关键的调控步骤[14-16]。目前，ASMT基因在水稻中被克隆[17-19]。

茶树属于中国重要的经济作物，茶叶更是人们喜欢的饮品，它与咖啡、可可被称为世界三大饮料。但茶树在生长过程中会遭受虫害等生物胁迫以及低温、干旱等非生物胁迫的困扰，严重影响茶叶产量和品质。ASMT基因在植物抗逆等生理活动中具有重要的作用，据文献报道水稻中ASMT基因在叶片衰老、除草剂、重金属等逆境条件下被显著诱导，在黑暗和高温条件下，ASMT的酶活性提高进而增加褪黑素的合成[20]。另外，水稻中ASMT基因均受ABA和MeJA不同程度的诱导表达[21]。在拟南芥中过量表达珠美海棠的ASMT基因后，拟南芥中的活性氧水平降低，提高了植株的抗旱性[22]。进一步研究ASMT基因抗逆的分子机制将为茶树抗逆分子育种提供理论依据。该研究基于本实验室茶树转录组数据库筛选出一条ASMT，通过RACE技术克隆基因全长，并进行生物信息学分析，构建pET-32a(+)/CsASMT和pMal-c2X/CsASMT原核表达质粒，诱导表达CsASMT蛋白，并采用荧光定量 PCR 技术，分析CsASMT在褪黑素处理、茶尺蠖取食和不同激素处理下的表达模式，有助于揭示CsASMT对生物胁迫和非生物胁迫信号响应过程中的作用，为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

材料为安徽舒城德昌2年生扦插苗盆栽，品种为国家无性系良种‘舒茶早’，茶尺蠖幼虫采自安徽潜山茶场。选取长势相对一致、健康、无病虫害侵害的‘舒茶早’茶苗，用褪黑素(100 μmol/L melatonin)、水杨酸(1 mmol/L SA)、脱落酸(100 μmol/L ABA)、茉莉酸甲酯(1 mmol/L MeJA含0.05% Tween-20)喷施叶面，用清水处理作为对照。取2～3龄茶尺蠖幼虫放于叶片上，待约1/3叶片被取食后移走幼虫，以未取食的作为对照。每个处理做3个生物学重复，按照处理3、6、9、12和24 h后采集相同叶位的幼嫩叶片，并立即置于液氮中，放入-80 ℃超低温冰箱内储存备用。

1.2 方 法

1.2.1茶树总RNA提取及cDNA合成按照RNAprep pure Plant Kit提取试剂盒说明书，以叶片为材料提取总RNA，用核酸蛋白测定仪检测总RNA 样品的浓度，1.2%凝胶电泳检测总RNA的完整性。按照PrimeScriptTMReverse Transcriptase Kit试剂盒说明书以总RNA为模板反转录成cDNA。

1.2.2茶树CsASMT基因的全长克隆利用软件Primer Premier 5 分别设计3′-RACE和5′-RACE引物(表1)，以反转录的cDNA为模板，参照SMARTTMRACE (Clontech)试剂盒说明书进行操作。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收目的条带并克隆，交由通用生物公司测序。测序结果利用Editseq软件进行拼接，根据拼接序列设计全长验证引物(表1)。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃反应60 s，72 ℃延伸10 min，30个循环。胶回收目的条带、克隆、测序。

1.2.3茶树CsASMT基因生物信息学分析蛋白的分子量和等电点利用ProtParam tool网站计算，TMHMM2.0预测蛋白的跨膜结构，SignalP4.1预测蛋白的信号肽，Scratch protein Predictor对蛋白质的二硫键及二级结构进行预测，使用SWISS-MODEL同源建模CsASMT蛋白的三级结构，用NCBI网站中的blastp在线分析软件和DNAMAN软件对序列进行比对分析，MEGA6.0软件构建系统进化树。

1.2.4原核表达载体的构建根据CsASMTORF和pET-32a(+)载体，设计带有BamHI和XhoI酶切位点的上下游引物(表1)，根据pMal-c2X载体，设计带有BamHI和PstI酶切位点的上下游引物(表1)。参照TransStartFastPfuDNA Polymerase试剂盒说明书扩增完整开放阅读框，用限制性内切酶分别酶切纯化产物和载体，用 T4 DNA 连接酶在16 ℃连接过夜，再转化到BL21(DE3)感受态细胞，用双酶切和测序验证。

表1 引物序列

1.2.5CsASMT基因的原核表达参考文献[23]方法，分别挑取测序正确的单克隆菌落接种于LB 培养基中37 ℃培养过夜，然后扩大培养至OD600为 0.6左右，取1 mL培养液至1.5 mL离心管中，10 000 r·min-1离心收集菌株。向剩余的菌液中加入50 μL的1 mol/L IPTG，28 ℃诱导表达6 h，取1 mL菌液备用，将最后剩余的诱导菌液，离心，弃尽上清，加入4 mL 1×PBS，并用移液器充分吹打混匀后，进行超声破碎处理。用SDS-PAGE检测蛋白表达情况，对照组分别为空载体pET-32a(+)和空载体pMal-c2X。

1.2.6CsASMT基因的表达分析荧光定量PCR分析在茶尺蠖取食、褪黑素、SA、ABA和MeJA处理后CsASMT的表达特征。提取样品总RNA，参照TAKARA公司SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR Kit说明书，反转录成荧光定量PCR模板。设计荧光定量PCR引物(表1)，以茶树GAPDH为内参基因，参照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书进行操作，定量结果采用2-ΔΔCt[24]分析。

2 结果与分析

2.1 CsASMT基因的全长克隆

根据筛选的CsASMT的EST序列，以茶树叶片cDNA为模板，采用RACE技术进行非嵌套和嵌套扩增，最终获得3′末端序列长度为490 bp(图1，A)，5′末端序列长度为710 bp(图1，B)，将序列进行拼接，用设计的全长引物进行cDNA 全长的特异性扩增，通过克隆测序获得CsASMT全长为1 282 bp(图1，C)。

2.2 CsASMT基因的生物信息学与系统进化树

生物信息学分析显示CsASMTORF全长1 065 bp，编码354个氨基酸，蛋白质分子量为38.98 kD，理论等电点为5.37。TMHMM2.0和SignalP4.1分析结果表明CsASMT蛋白未发现跨膜结构和信号肽，属于非分泌蛋白。Scratch protein Predictor预测CsASMT存在3个二硫键。利用PredictProtein进行CsASMT蛋白的二级结构预测，结果显示α-螺旋占49.44%，β-折叠占14.69%，无规卷曲占35.88%。用SWISS-MODEL模拟CsASMT蛋白的三维结构，以PDB ID:5icc.1.A为模型进行同源建模(图2)，其一致性为42.57%，GMEQ值为0.75，说明该模型建立的可信度较高。

利用软件MEGA6.0中的N-J的方法构建系统进化树(图3)，由图可知CsASMT大致可以分为两大类，CsASMT与MzASMT9亲缘关系最近。对CsASMT氨基酸序列进行多重序列比对分析(图4)，结果发现这些不同种类的CsASMT蛋白都具有腺苷蛋氨酸(SAM)结合位点，以及N-乙酰基-5-羟色胺(NAS)保守结构域。

M. DL2000；A.3′-RACE：1.非嵌套扩增产物；2.嵌套扩增产物；B.5′-RACE：1.非嵌套扩增产物；2.嵌套扩增产物；C.CsASMT图1 CsASMT基因全长扩增M. DL2000; A. 3′-RACE: 1. The product of Non nested PCR; 2. The product of nested PCR; B. 5′-RACE: 1. The product of Non nested PCR; 2. The product of nested PCR; C. CsASMTFig.1 The full-length amplification of the CsASMT

图2 预测的CsASMT 蛋白三级结构Fig.2 Tertiary structure prediction of protein CsASMT

2.3 CsASMT基因的原核表达

用限制性内切酶对重组质粒进行双酶切，可得到2条带，其中1条在1 065 bp左右，经测序验证与CsASMT完全一致，表明重组质粒构建成功。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3) pLysS后，在28 ℃、0.5 mmol/L IPTG、6 h下诱导表达，实验表明pET-32a(+)/CsASMT诱导后全部以包涵体蛋白的形式表达(图5，A)，pMal-c2X/CsASMT诱导后蛋白以可溶蛋白和包涵体蛋白两种形式存在(图5，B)，在上清分子质量约为79 kD处有明显的新增蛋白带，而空载体对照在此处无表达条带。因为表达载体中含有重组麦芽糖结合蛋白，所以表达的分子量比预测大。

图3 CsASMT蛋白与不同种类的ASMT蛋白的系统发育树Fig.3 Phylogenetic relationship between CsASMT and ASMT proteins from others

2.4 CsASMT基因在不同激素处理后的表达特征分析

采用qRT-PCR对CsASMT基因在茶尺蠖取食、褪黑素、SA、ABA和MeJA处理后的表达进行检测，结果显示(图6)：在茶尺蠖取食后，CsASMT各个时间点均为下调表达；在100 μmol/L melatonin处理后，CsASMT经诱导6、9和12 h后均为上调表达，且第9 h表达量达到最高，约是对照的1.7倍；茶树在1 mmol/L MeJA处理后，CsASMT基因在9 h为上调表达，约是对照组的1.2倍，在其他时间点均为下调表达；茶树在100 μmol/L ABA和1 mmol/L SA处理后，CsASMT在各时间点表达量显著上调，都在9 h表达量最高，分别约是对照组的7.3倍和7.5倍。

3 讨 论

植物生长发育过程中常受到虫害等生物胁迫和高盐、干旱、低温等非生物胁迫的伤害，严重时会导致植株死亡，茶树是极易受到恶劣环境影响的经济作物之一。 褪黑素作为植物中有效的内源性自由基清除剂，或通过参与多胺等物质的合成，或通过调节抗氧化系统酶的基因转录水平，扮演植物中的第一道防线的角色[25]，防止生物胁迫和非生物胁迫对植物的伤害。N-乙酰基-5-羟色胺甲基转移酶(ASMT)是褪黑素合成途径的关键限速酶，它可以催化N-乙酰基-5-羟色胺(N-acetylserotonin)生成褪黑素。

OsASMT1、OsASMT2、OsASMT3.水稻(AK072740、AK069308、AAL34945)；CsASMT.茶树; AtASMT.拟南芥(At5g54160)；三角形为腺苷蛋氨酸(SAM)结合位点，长方形为推测的N-乙酰基-5-羟色胺(NAS)结构域图4 CsASMT和其他植物的ASMT序列比对分析OsASMT1, OsASMT2, OsASMT3. Oryza sativa(AK072740, AK069308, AAL34945); CsASMT. Camellia sinensis; AtASMT. Arabidopsis thaliana(At5g54160); The triangle is the binding site of adenosine methionine (SAM), and the rectangle is the predicted structural domain of N-acetyl-5-hydroxytryptamine (NAS)Fig.4 Alignment of amino acid sequences of CsASMT and other plant ASMT

M.蛋白标准分子量；A.pET-32a(+)/CsASMT诱导表达：1.pET-32a(+)诱导前；2.pET-32a(+)诱导后上清；3.pET-32a(+)诱导后沉淀；4.pET-32a(+)/CsASMT诱导前；5.pET-32a(+)/CsASMT诱导后上清；6.pET-32a(+)/CsASMT诱导后沉淀；7.pET-32a(+)/CsASMT破碎后上清；8.pET-32a(+)/CsASMT破碎后沉淀；B.pMal-c2X/CsASMT诱导表达：1.pMal-c2X/CsASMT破碎后沉淀；2.pMal-c2X/CsASMT破碎后上清；3.pMal-c2X/CsASMT诱导后沉淀；4.pMal-c2X/CsASMT诱导后上清；5.pMal-c2X/CsASMT诱导前；6.pMal-c2X诱导后；7.pMal-c2X诱导前图5 CsASMT诱导表达M. Protein marker; A.pET-32a(+)/ASMT induced expression: 1. pET-32a(+) before induction; 2.pET-32a(+)supernatant after induction; 3.pET-32a(+)precipitation of lysate afterinduction; 4.pET-32a(+)/CsASMT before induction;5.pET-32a(+)/CsASMT supernatant after induction; 6.pET-32a(+)/CsASMT precipitation of lysate afterinduction: 7.pET-32a(+)/CsASMT supernatant aftersonication; 8.pET-32a(+)/CsASMT precipitation of lysate aftesonication;B.pMal-c2X/CsASMT induced expression: 1.pMal-c2X/CsASMT precipitation of lysate after sonication; 2.pMal-c2X/CsASMT supernatant after sonication; 3.pMal-c2X/CsASMT precipitation of lysate after induction: 4.pMal-c2X/CsASMT supernatant after induction; 5.pMal-c2X/CsASMT before induction;6.pMal-c2X after induction; 7.pMal-c2X before inductionFig.5 SDS-PAGE analysis of CsASMT expression

* 代表该处理下CsASMT基因表达量与0 h(未处理)的表达量存在显著差异(P<0.05)图6 在不同激素、茶尺蠖取食和褪黑素处理后CsASMT基因相对表达量的qRT-PCR分析* means that the expression of CsASMT gene is significantly different between the treatment time 0 h (untreated conditions) and other treatment time under the same condition at 0.05 levelFig.6 qRT-PCR analysis of CsASMT gene relative expression levels in C. sinesis treated with different hormones, attacked by Ectropic obliqua and treated with melatonin

本研究从茶树中克隆了一条CsASMT基因的cDNA全长序列，该基因编码354个氨基酸，分子量为38.98 kD。多序列比对分析表明茶树的CsASMT在结构和同源性方面与其他植物存在着一定的差异，但不同种类的CsASMT蛋白都具有腺苷蛋氨酸(SAM)结合位点，以及N-乙酰基-5-羟色胺(NAS)保守结构域，这与Kang等[18]首次在水稻中克隆的ASMT结果相一致。进化树分析表明，茶树CsASMT氨基酸序列在进化上与珠美海棠在同一分支上，说明它们在同源关系上最为接近。

大肠杆菌表达系统是技术最成熟、开发最早的外源蛋白原核表达系统[26]，将重组质粒导入大肠杆菌进行诱导表达，pET-32a(+)/CsASMT经诱导后蛋白在包涵体中表达，而pMal-c2X/CsASMT经诱导后在上清和包涵体内均有表达，王志军[27]同样采用了这2种原核表达载体，构建了EtKR表达质粒，经诱导表达后结果与本研究结果一致。不同的表达载体构建的重组质粒诱导蛋白表达的位置不同，分析表达载体特点，表达载体包括众多元件如启动子、融合标签、终止子等，在这些元件中对外源蛋白的高效表达影响最大的元件是启动子和融合标签。pET-32a(+)启动子为T7启动子，T7具有很强的启动转录功能，而pMal-c2X载体启动子是Tac，其启动复制能力弱于T7启动子，当蛋白表达时，T7启动子由于具有很强的启动转录功能，造成了重组表达的蛋白多肽错误的折叠，使蛋白以包涵体的形式存在。另外，pET-32a(+)载体N端带有Trx和His标签，pMal-c2X载体带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签，MBP融合标签在可溶性蛋白表达上具有明显的优势，它能够引导重组蛋白的正确折叠，在一定程度上增加所表达蛋白的可溶性，大量可溶性蛋白的获得为CsASMT蛋白的功能研究奠定了一定的基础。

本研究检测了CsASMT基因在茶尺蠖取食、褪黑素、SA、ABA和MeJA处理后的表达模式，证实该基因与茶树的逆境响应密切相关。目前, 褪黑素在植物抗虫性中作用的研究还较少。茶尺蠖取食后，CsASMT基因呈下调模式，表明该基因在害虫取食中可能起负调控作用。据文献报道褪黑素是一种植物激素[28]，外源激素与内源激素具有协同与拮抗作用，喷施外源激素后内源激素也发生相应的变化[29]。Arnao等[30]发现外源褪黑素经大麦根吸收后，也会诱导内源褪黑素含量增加。SUN等[31]用500 μmol/L褪黑素处理番茄后，番茄内褪黑素含量约是对照的31倍。本研究发现外源褪黑素处理后CsASMT能够上调表达，从而加快褪黑素的合成。外源激素的喷施对植物生长也具有重要的调控作用，SA、ABA和MeJA刺激能够快速诱导植物进行响应，Park等[21]对水稻中的3个ASMT同源基因进行了研究，发现基因表达均受SA、ABA和MeJA的诱导。本研究结果表明：ABA和SA分别在处理6和3 h后，CsASMT的表达水平就发生了显著变化，且上调倍数较大。与ABA和SA处理相比，在MeJA 处理后，CsASMT基因只在9 h后呈上调表达。结合SA、ABA和MeJA 三者都在植物的抗逆过程中发挥重要作用，推测CsASMT可能与茶树抗逆有关。但是，CsASMT基因在植物抗逆、抗虫过程中是否发挥作用，需要通过遗传转化等手段进行验证。