动物源性食品中β-受体兴奋剂类多残留检测方法研究

◎ 谭 策，赵 琪，甄 珍，谭阳阳

（1.齐齐哈尔海关，黑龙江 齐齐哈尔 161005；2.牡丹江海关，黑龙江 牡丹江 157000）

本文通过对QuEChERS方法进行改进研究，通过高效液相色谱-串联质谱检测，形成快速的动物组织中β-受体兴奋剂类药物残留定量定性检测方法。对现有动物源性食品组织样品的前处理方法进行条件优化，并建立新的简单、净化效果良好、灵敏度高且能满足日常的检测需要的检测方法。克服目前β-受体兴奋剂类药物残留分析方法的不足。

1 QuEChERS方法应用前处理

1.1 材料和方法

1.1.1 主要试剂和材料

主要试剂和材料见表1。

表1 主要试剂和材料表

①1 mol/L乙酸铵溶液。称取19.27 g乙酸铵。用水溶解定容至250 mL。②5 mmol/L乙酸铵溶液。将5 mL 1 mol/L乙酸铵溶液溶解于1L超纯水中。③4%氨水-乙酸乙酯溶液。量取20 mL氨水于500 mL乙酸乙酯中，摇匀。④5%甲酸-乙腈溶液。量取5 mL甲酸加入95 mL乙腈中。

1.1.2 主要标准品

主要标准品见表2。

表2 主要标准品表

（1）标准储备液的配制。分别吸取克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗标准品1 mL于25 mL储液瓶中，用甲醇溶解，定容到10mL。得到10 μg/mL的标准品储备液。保存在-20 ℃冰箱里，有效期为6个月。

（2）标准中间液的配制。分别吸取克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗标准储备液1 mL于25 mL储液瓶中，用甲醇∶水=9∶1的溶液进行稀释，定容至10 mL，得到1 μg/mL混合标准中间液。4 ℃冰箱中保存，有效期为3个月。

1.1.3 主要设备

液相色谱-质谱联用仪：型号Thermo TSQ Quantum Access MAX，美国热电公司；天平：感量0.01 g，瑞士梅特勒公司；组织匀浆机：型号IKAT25。高速离心机：型号L-550，湘仪牌；涡旋混匀器：型号IKAMS3；电热恒温水浴锅；pH测定仪：型号FE28-Standard，品牌瑞士梅特勒托利多；电热干燥箱：型号OGS100，品牌赛默飞世尔；固相萃取装置：型号Supelco，12孔。

1.1.4 样品来源与准备

分别在前往农贸市场、大福源超市购买牛肌肉、牛肝脏、猪肌肉以及猪肝脏，利用粉碎机对牛肌肉、牛肝脏、猪肌肉以及猪肝脏进行绞碎，对样品进行均质搅拌，确保样品均匀。经过处理的样品塑封包装好后放入冰箱冷鲜层备用。

1.2 方法建立

1.2.1 测定步骤

称取粉碎均匀的动物源性组织（2±0.1）g，加入到50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入5%甲酸乙腈10 mL，立即用涡旋振荡器混合2 min，在5 000 r/min下离心5 min备用，将5 mL乙酸铵缓冲液（5 mmol/L）加入到15 mL EMR-lipid dSPE净化管中，从离心管中移取5 mL上清液加入到已经活化好的EMR-lipid净化管中净化，立即使用涡旋振荡器混合2 min，在5 000 r/min下离心3 min，取离心后上清液5 mL加入到含有2 g（NaCl与MgSO4的比例为1∶4）盐的15 mL EMR-Lipid Polish反萃管中，并涡旋混合1 min，在5 000 r/min下离心3 min，取上清液1 mL在45 ℃氮吹仪下吹至近干，用甲醇+0.1%甲酸水溶液（10+90，V/V）1 mL定容，供高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测。

1.2.2 方法优化

现有的前处理步骤常采用乙腈和水混合液进行提取，然后利用SPE小柱或其他净化技术进行净化。SPE小柱去除动物源性样品中杂质的能力有限，而且在稀释或复溶过程中易出现沉淀。如果有沉淀则要在装入进样小瓶之前对溶液进行过滤，分析物可能造成损失。有研究证明在固相萃取（dSPE）过程中可以加入正己烷等溶剂去除提取液中的脂肪等杂质，但这种方式具体实施步骤繁琐，而且没有特异性，疏水性分析物也会被去除。传统SPE填料常常为C18，与其相比使用氧化铝填料的方式能够提高净化效果，但是会导致大量分析物流失。如果测定的化合物中含有羧酸和羟基的话，流失更会严重。现今QuEChERS方法很好地解决了上述问题。不过这种方法的缺点是样品前处理过于简单，造成部分脂肪去除效果不好。部分脂肪将与目标分析物一起保留到最终定溶液中。造成色谱分离难度加大、质谱确证不准确和灵敏度下降以及质谱清洗频繁等问题。脂肪的干扰是QuEChERS方法干扰重点，因此去除它对于方法的进展来说非常重要。Agilent QuEChERS类的增强型脂质去除产品是一种新型吸附剂材料。很好地弥补了QuEChERS方法对动物源性兽药多残留检测时的缺点。

同时，实验过程中比较了传统SPE C18填料、氧化铝填料吸附剂、Agilent QuEChERS类的增强型脂质去除填料与空白基质去除能力的比较。实验方式为基质中加入相同浓度的标准溶液后，通过净化对比不同的响应差异。得到结果表明，选用增强型脂质去除填料的方法，脂肪去除率最好，标准品信噪比最高。

1.2.3 质谱的优化

通过对β-受体兴奋剂类药物的性质及结构分析得出，离子源选择ESI源正离子模式。使用清洗过的注射泵吸取一定量浓度约10 μg/mLβ-受体兴奋剂类标准中间液，连接到液相色谱-串联质谱仪，流动相选择和进样相同的比例和溶剂。全扫描，找到母离子。在监视窗显示得到目标母离子强度超过e7以上时，确定每种β-兴奋剂类药物的分子离子。然后利用软件对母离子进行自动二级质谱全扫描，选择5个信号大的子离子。最后选择信号强度较大的两个碎片离子为特征子离子，并优化得到每种β-兴奋剂类药物的母离子和子离子所需的最佳锥孔电压和碰撞能量，最后以多反应监测模式进行扫描。在正离子模式下的目标物母离子强度必须在e7左右，确保MS/MS状态下自动筛选子离子结果更好，离子强度达不到要求的情况下，可以增大标准品溶液浓度或加快注射泵速度。主要需要优化的参数有Tube Lens Offset、鞘气、辅助气和Skimmer Offset。得到最优化质谱参数见表3。标准品子离子扫描色谱图见图1。

表3 优化质谱参数表

图1 β-受体兴奋剂类标准品定量离子色谱图

2 结论

本研究优化了传统酶解前处理方法，建立了牛和猪的肌肉、肝脏中4种主要β-受体兴奋剂的多残留检测方法。采用β-盐酸葡萄糖醛苷酶水解，碱化乙酸乙酯提取，SPE柱净化。采用碱化乙酸乙酯作为新的提取方法，回收率平均提高了8.5个百分点（见表4），并且干扰杂质很少，前处理过程简单，其灵敏度大幅度优于传统方法（见表5）。液相色谱-串联质谱法选择MRM模式，同时进行定量和确证，该方法灵敏度高、能满足检测需要。试验中选择了母离子以及对应产生的两个响应较强的子离子作为定性定量的依据，完全满足国内及欧盟对确证方法的要求。

表4 优化前后回收率比较表

表5 优化前后检出限比较表

通过对QuEChERS方法进行改进研究和高效液相色谱-串联质谱检测，最后形成对β-受体兴奋剂类药物在动物组织中的残留的定量定性快速检测方法。与国家标准方法和文献报道方法相比，QuEChERS方法检测β-受体兴奋剂类时的前处理用时4 h，而酶解法前处理用时16 h，可见，QuEChERS方法的用时短、成本低，同时回收率保证在70%～75%，检出限在0.5 μg/kg以下，此方法可以成为快速、可靠与稳定的前处理方法。

本研究通过完善和建立不同的前处理方法，使得β-受体兴奋剂类药物在动物组织中残留的检测变得更加快捷和准确。研究的成功将为保证动物源性食品安全提供一项重要的技术支持，对规范养殖行业，保障人民生活健康，解决国内外贸易纠纷起到积极作用，为仲裁或政府监督、检查提供科学依据。