C2C在马骨关节炎模型滑液中的含量变化

宋霄鹏，王冠颖，李 玥，马天文，白 荟，张志恒，高 利

(东北农业大学动物医学学院，黑龙江省实验动物与比较医学重点实验窒，黑龙江哈尔滨 150030)

马骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种临床常见的关节退行性疾病。OA引起的跛行是影响马使用的比较严重的疾病。OA的诊断依赖于晚期不可逆阶段的临床症状和影像学检查。缺乏早期敏感的血清或滑液生物标志物。此外，在马OA发病过程中，关节软骨损伤是主要特征，产生软骨代谢降解产物分泌到关节滑液(synovial fluid,SF)中。生物标志物可以在影像学迹象出现之前的早期阶段检测到OA[2]。推测生物标志物可以预测马OA，监测治疗进展，并可用于评估马OA的发病程度。随着分子生物学发展，体液中的部分生物标志物在OA诊断方面的作用日益受到国内外学者的重视，其中Ⅱ型胶原(collagen Ⅱ,CⅡ)的代谢产物已成为研究的热点之一。

C2C是Ⅱ型胶原C末端3/4长度的裂解碎片，C2C只在Ⅱ型胶原降解时产生。有学者认为，C2C在OA患者尿液中升高[3]。但目前尚未有研究发现C2C对OA诊断的定量研究，为能及早发现、干预、治疗，从而延缓马OA的疾病发展。试验旨在采用夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定马OA模型SF中C2C浓度，探讨马OA疾病发展与SF中C2C浓度的关系，为进一步实现马OA滑液中生物标志物的检测达到能早期诊断马骨关节炎，进而缓解我国诊断、治疗马OA的经济压力，达到早期预防的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 于黑龙江省肇东市某养殖场购进13匹蒙古马，平均体重为420 kg(331 kg～487 kg)，平均年龄7岁(6岁～8岁)，对每匹马进行体况评分[1]，得分均在4分～6分之间，无肢蹄病史且临床检查没有肢蹄病症状。将该13匹马随机分为试验组(n=8)和对照组(n=5)。试验前，将马匹栓养在硬场地上随意采食饲料饲养2周，以适应环境。

1.1.2 试剂 盐酸美沙酮、盐酸地托咪定、生理盐水均购于Sigma公司；马C2C成品ELISA试剂盒，批号070082Eq，购于上海赛默生物科技发展有限公司；两性霉素B，批号1633C219，购于Amresco公司。

1.2 方法

1.2.1 造模 将13匹蒙古马随机分为两组，试验组8匹，对照组5匹。试验开始前，给马静脉注射盐酸美沙酮(0.1 mg/kg)和盐酸地托咪定(0.1 μg/kg)进行镇静。造模组在马左侧腕关节腔内注入2 mL无菌的两性霉素B稀释液(25 mg/mL)，诱导马OA模型。对照组关节腔注入2 mL无菌的生理盐水。

1.2.2 关节滑液采集及临床指标检测 在注射两性霉素B之前所有马匹收集0.5 mL～1 mL的关节滑液，在注射药物建立马OA模型后每周采取滑液一次直至第9周试验结束。无菌条件下，在EP管中收集样品。于1 h内将收集样品以10 000 r/min离心15 min，取上清液，并储存-80℃备用，每周采用ELISA试剂盒测定试验组和对照组马SF中C2C的浓度，严格按照ELISA试剂盒说明书操作。每次收集SF后，记录马的直肠温度，呼吸频率，脉搏和腕关节周长。此外，跛行每周评估一次，并使用美国马兽医协会(AAEP)分级标准进行跛行评估，具体情况如下：马在行走时跛行很难被发现，在特定的环境(如负重、转圈、斜面和硬地面) 下出现的间断性明显跛行为1级跛行；马在正常行走或沿直线行走时跛行很难被发现，在特定的环境(如负重、转圈、斜面和硬地面) 下出现的持续性明显跛行为2级跛行；在任何情况下都出现的明显跛行为3级跛行；伴随低头和步幅缩小的明显跛行为4级跛行；在最小负重条件下出现不愿走动或处于休息状态的跛行为5级跛行。

1.2.3 统计学分析 使用SPSS 19.0数据分析系统做重复测量方差分析和t检验进行统计学分析，结果表示为平均值±标准差。P<0.05为差异显著，有统计学意义。

2 结果

2.1 临床症状

所有马匹在注射两性霉素B之前都无跛行，其他临床症状均正常。两性霉素B注射导致腕关节周长显着增加(图1)，在建立马OA模型后的前2周，马表现1级跛行。在3周～5周表现2级跛行，6周～8周表现3级跛行，第9周表现5级跛行，证明马出现疼痛感和炎性肿胀，造模成功。左腕关节注射无菌生理盐溶液并未导致跛行。

*与对照组比较差异性显著(P<0.05)* Significant difference compared with the control group (P<0.05)

2.2 关节滑液中C2C浓度变化

与对照组相比，在9周内C2C浓度随OA发病时间的增加而升高(图2)，从第2周开始显著增加(P<0.05)，第4周开始极显著增加(P<0.01)并保持增加趋势直到第9周。

3 讨论

马OA主要特征表现为关节软骨的降解，关节软骨主要由是由Ⅱ型胶原纤维(CⅡ)及特异型软骨组成。

*与对照组比较差异性显著(P<0.05)，**与对照组比较差异性极显著 (P<0.01)

* Significant difference compared with the control group (P<0.05),** Extremely significant difference compared with the control group (P<0.01)

图2关节滑液中C2C浓度在9周内的变化

Fig.2 Changes in C2C concentrations in synovial fluid within 9 weeks

软骨组织是Ⅱ型胶原的唯一来源，其约占软骨干重的60%，因此对Ⅱ型胶原代谢产物的检测可评估软骨的降解[4]。C2C是Ⅱ型胶原C末端3/4长度的裂解碎片，作为判断Ⅱ型胶原裂解的主要片段，国内外研究学者在兽医临床和人类医学方面做了相应的研究。在人类OA研究中发现，患病关节SF中C2C浓度显著增加，且浓度的升高程度与损伤程度有关[6]。此外，在建立狗OA模型后，第3周和第12周SF中C2C浓度显著升高。和对照组比较，在造模后12周后，尿液和血清中C2C浓度显著升高[3]。但也有学者认为，OA患者的SF、血清和尿液中C2C浓度没有显著的不同，得出结论为C2C在作为OA病理指标时浓度变化不稳定[5]。

在本研究中，我们使用关节内注射两性霉素B诱导马OA模型，在此前用此方法成功建立动物模型[6]。驴的OA模型由Mokbel A N等[7]建立，3周后出现轻度症状，6周后出现中度症状，9周出现严重症状。关节疾病是马的常见疾病，影响马的健康和使用价值，在诊断上也没有特别快速有效的方法，马的腕关节比较大，关节液量多，检测关节液中的指标可以为马关节疾病的诊疗提供方向。本试验通过化学方法诱导建立马OA模型，相比手术方法诱导OA模型可以减少创伤性滑膜炎的发生机率。在马的腕关节内注入两性霉素B，可以观测到在注射药物后的第3周开始出现不同程度的OA临床症状，出现不同程度的跛行，同时伴随关节肿胀。此外，马OA模型是用于评估人类OA相关病理学良好的翻译模型[8]。由于缺乏检测马早期OA的生物标志物，所以本研究通过检测SF中Ⅱ型胶原分解代谢产物中C2C浓度，直接准确的探讨C2C浓度与关节软骨病变程度间的关系。在狗与鼠的OA研究中，受损伤的关节SF中C2C浓度增加[9]。在羊的实验性OA模型中，关节软骨发生增厚型损伤，C2C浓度增加[10]。此外，在马OA研究中，SF中C2C的浓度显著增加[11]，在试验性OA早期出现同样的变化[12]。在整个试验过程中，对照组在注射生理盐水后在9周内C2C无明显变化，试验组在注射两性霉素B后用ELISA方法检测SF中C2C浓度，结果显示从第2周开始显著增加(P<0.05)，第4周开始极显著增加(P<0.01)并保持增加趋势直到第9周试验结束。试验组在关节内注射两性霉素B后第3周开始出现不同程度跛行，并且在跛行前就已经出现了C2C浓度的显著升高，这一结果与人OA病变过程中C2C变化趋势相符。

结果证明Ⅱ型胶原降解发生在马骨关节临床症状出现之前，并且SF中Ⅱ型胶原降解产物C2C浓度升高。由此推测C2C可以作为马早期OA诊断的生物标志，文中使用的临时模型有助于识别在马关节疾病中发生变化的生物标志物来评估OA治疗。