循经选穴针刺对失眠大鼠下丘脑腹外侧视前区褪黑素含量及其受体基因表达的影响

谢莉娜 谢志强 郭鑫 魏歆然 岳增辉

摘要：目的 观察循经选穴针刺对失眠大鼠下丘脑腹外侧视前区褪黑素（MT）含量及其受体MT1、MT2基因表达的影响，探讨针刺治疗失眠症的作用机制及循经选穴针刺对腧穴配伍的效应。方法 将60只SD大鼠随机分为空白组、模型组、百会+神门组、百会+三阴交组、百会+非经非穴组，每组12只。大鼠腹腔注射DL-4-氯苯基丙氨酸混悬液建立失眠模型，各治疗组针刺相应腧穴，每次30 min，治疗7 d。采用ELISA检测大鼠下丘脑腹外侧视前区MT含量；采用实时荧光定量PCR检测大鼠下丘脑腹外侧视前区MT1、MT2 mRNA表达。结果 与空白组比较，模型组MT含量及MT1、MT2 mRNA表达明显降低（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，各针刺组MT含量及MT1、MT2 mRNA表达明显升高（P<0.05，P<0.01），且以百会+神门组升高最为明显。结论 针刺通过调节失眠大鼠下丘脑腹外侧视前区MT含量及其受体MT1、MT2 mRNA的表达发挥治疗作用，且循经选穴针刺可能是腧穴配伍效应的影响因素之一。

关键词：针刺；失眠；褪黑素；褪黑素受体1a；褪黑素受体1b；循经选穴；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.011

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）12-0040-05

Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture treatment based on meridians and acupoint selection on the melatonin （MT） content and the expression of MT1 and MT2 genes in the ventrolateral preoptic area （VLPO） of insomnia rats； To investigate the therapeutic mechanism of acupuncture in treating insomnia and the effect of acupuncture treatment based on meridians and acupoint selection on compatibility effect of acupoints. Methods Totally sixty SD rats were randomly divided into blank group， model group， Baihui + Shenmen group， Baihui + Sanyinjiao group and Baihui + non-acupoint group， with 12 rats in each group. Chlorophenylalanine suspension was intraperitoneal injected to establish insomnia model rats. Each treatment group received acupuncture in relevant acupoints， 30 min each time， for 7 d. Levels of MT in the VLPO were detected by ELISA， and real-time fluorescence quantitative PCR was used to measure the expressions of MT1 and MT2 mRNA in VLPO of rats. Results Compared with blank group， levels of MT and expressions of MT1 and MT2 mRNA in model group decreased significantly （P<0.05， P<0.01）； Compared with model group， levels of MT and expressions of MT1 and MT2 mRNA in acupuncture groups increased significantly （P<0.05， P<0.01）， and Baihui + Shenmen group increased the most obvious. Conclusion Acupuncture treatment can play a therapeutic role by regulating levels of MT and the expressions of MT1 and MT2 mRNA in the VLPO of insomnia rats， and acupuncture treatment based on meridians and acupoint selection may be one of the factors that cause the difference of compatibility effect of acupoints.

Keywords： acupuncture； insomnia； melatonin； MT1； MT2； meridians and acupoint selection； rats

失眠是一種最常见的睡眠障碍，主要特点为持续长时间不能获得正常睡眠或对睡眠质量不满意。其病因和发病机制复杂，患病率在快节奏生活方式的现代社会中有逐年增高趋势，世界范围内失眠障碍临床患病率约为10%～12%[1]。研究表明，睡眠是大脑中调节睡眠-觉醒周期的多个中心共同参与的神经化学过程，而下丘脑腹外侧视前区（ventrolateral preoptic area，VLPO）为其中一主要结构[2-3]。褪黑素（melatonin，MT）于1959年被国外学者首次发现，在人体广泛分布，主要存在于视交叉上核，为松果体分泌的吲哚类激素，研究发现其有镇静催眠和调节睡眠觉醒周期的作用[4]。研究表明，褪黑素调节睡眠是通过与褪黑素受体1a（MT1）、褪黑素受体1b（MT2）作用来实现，而这两受体作用方式不同，前者主要抑制神经元活动，后者主要诱导相位转变[5]。

近年来，针刺治疗失眠疗效显著[6]，且越来越被患者接受。临床上针刺治疗失眠选穴方法多样，正确的腧穴配伍是提高针刺疗效的关键因素之一，不同的腧穴配伍方式与针刺治疗失眠的疗效密切相关[7-8]。而循经选穴作为腧穴配伍的重要原则之一，主要是指根据经脉循行所过部位的病变、经脉所属脏腑的病变选择相应经脉上的腧穴进行治疗的方法[9]。本研究通过固定按部选穴（百会），对比配伍本经穴、他经穴、非经非穴对失眠大鼠VLPO区MT1、MT2表达的影响，探讨针刺治疗失眠的疗效机制及循经选穴针刺对腧穴配伍效应的影响，为临床针灸治疗失眠的选穴原则及配穴方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

SD雄性大鼠60只，SPF级，8～9周龄，体质量220～250 g，湖南中医药大学实验动物中心，动物合格证号SCXK（湘）2013-0004。实验开始前，大鼠适应性饲养1周，每笼5只，饲养于湖南中医药大学实验动物中心实验室，温度23～26 ℃，相对湿度45%～65%，所有动物在同等条件下按组分笼喂养，自由摄食饮水，适应性喂养1周。将大鼠随机分为空白组、模型组、百会+神门组、百会+三阴交组、百会+非经非穴组，每组12只。

1.2 主要试剂及仪器

DL-4-氯苯基丙氨酸（PCPA），美国Sigma公司；戊巴比妥钠，Merck公司；碳酸氢钠片、氢氧化钠片，成都市科龙化工试剂厂；阿拉伯胶，天津市光复精细化工研究所；动物型超纯水机，摩尔公司；pH精密试纸（5.5～9.0），垫中垫公司；电热水恒温杯，Promega公司；RNA提取试剂Trizol Reagent，Invitrogen公司；反转录（M-MLV）、核糖核酸酶抑制剂（RNasin）、dNTP、Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）、随机引物（Random primers）、琼脂糖（agarose），美国Promega公司；荧光定量试剂盒（SYBR Green qPCR），Promega公司；實时荧光定量PCR扩增仪，ABI 7500 FAST，美国ABI公司；ABI 7300 Real-Time PCR System，美国ABI公司；超低温冰箱，德国贺利氏公司；UVP凝胶扫描系统，美国UVP公司；微量移液器，德国Gilson公司；DYZ-22A型双恒定时电泳仪、DYY-Ⅱ桥式电泳仪，北京六一仪器厂；台式高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；0.25 mm×25 mm华佗牌一次性使用无菌针灸针，苏州医疗用品厂有限公司。

1.3 造模

采用经典PCPA方法建立失眠大鼠模型[10]。实验前大鼠称重；除空白组外，其余组第8日开始腹腔注射PCPA混悬液（500 mg/kg，50 mg/mL），1次/d，连续2 d，制作失眠大鼠模型。具体操作：PCPA临用前按大鼠体质量用事先配制的弱碱性生理盐水（pH值7～8）配制成混悬液。预实验测得PCPA按大鼠体质量35 mg/kg剂量腹腔注射为引起100%大鼠睡眠的最小阈剂量。用注射器取与大鼠体质量相应剂量的混悬液腹腔注射。同时，空白组取等体积弱碱性生理盐水腹腔注射。首次注射PCPA混悬液36 h后，观察模型组大鼠生理状态，失眠大鼠出现昼夜节律缺失、日间与夜晚皆活动不断、对外界刺激异常敏感、烦躁不安等相关症状，结合经典的戊巴比妥钠翻正实验，观察空白组与模型组大鼠睡眠潜伏期及睡眠总时间的差异，进行失眠模型评价，若模型组与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05），则提示造模成功[11]。

1.4 干预

造模后，于第2次注射PCPA混悬液24 h后，开始对实验大鼠进行干预。各针刺组大鼠选穴参考大鼠穴位定位[12]。

空白组：大鼠常规饲养，不做任何处理；模型组：大鼠予以仰卧位束缚于鼠板上，只捆绑，不进行针刺，每日1次，30 min/次，连续7 d，每日捆绑结束后正常进食；百会+神门组选取“百会”（位于顶骨正中处）、双侧“神门”（位于前肢内侧腕部横纹尺骨边缘）；百会+三阴交组选取“百会”、双侧“三阴交”（位于后肢内踝尖直上10 mm）；百会+非经非穴组选取“百会”、非经非穴点（位于肘内侧，肘尖与腋窝连线中点，在非经脉循行路线上及非穴位所在部位，此点参照成都中医药大学所制定的选穴方法）。具体操作如下：将大鼠仰卧位束缚于鼠板上，定穴后剪毛、消毒，0.25 mm×25 mm华佗牌针灸针进行针刺，“百会”从后向前平刺20 mm，“神门”直刺1 mm，“三阴交”和非经非穴点均直刺5 mm，留针30 min，每10 min行针1次，行针时间1 min，不提插、只捻转，行平补平泻手法，幅度和频率为均等手法，30 min时，在行针结束后出针，每日1次，每日治疗后正常进食，连续7 d。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 行为学观察

观察大鼠精神状态、动作与反应灵敏性、昼夜节律、体质量及活动度、饮食、饮水等与失眠相关的指标变化。

1.5.2 ELISA检测褪黑素含量

所有大鼠于末次治疗后，禁食不禁水12 h，断头处死后立即剪开颅骨顶骨、硬脑膜，冰台上取出VLPO区组织，置于-80 ℃冰箱保存。测定时以空白管调零，450 nm波长依序测量各孔吸光度（OD值）。测定应在加终止液后10 min内进行。严格按试剂盒说明书操作。根据标准品浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再将样品的OD值代入回归方程计算出样品浓度。

1.5.3 实时荧光定量PCR检测褪黑素受体1、2基因表达

实时荧光定量PCR检测严格按说明书进行操作。冰浴条件下超声粉碎VLPO区组织，离心，先后加入氯仿、异丙醇、75%乙醇，RPE Solution，离心，再加入75%乙醇，离心，加入30 μL DEPC-treated ddH2O，放置5 min，离心，即得RNA溶液；电泳槽中电泳后，定性检验提取RNA质量，行反转录反应，最终放入荧光定量PCR仪进行定量反应，计算PCR产物2-ΔΔCt值，即相对定量法测定初始模板量。引物序列见表1。

1.6 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，经检验满足正态性及方差齐性，采用方差分析，用LSD法进行多重比较；不满足方差齐性，用Tamhane'T2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 睡眠实验结果

空白组造模前后睡眠潜伏期及睡眠总时间比较差异无统计学意义（P>0.05）；造模组大鼠注射戊巴比妥钠后，与造模前比较，造模后睡眠潜伏期显著延长，差异有统计学意义（P<0.05），睡眠总时间显著缩短，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

2.2 大鼠死亡情况

实验中共有7只大鼠死亡，其中模型组4只，百会+三阴交组1只，百会+非经非穴组2只。

2.3 大鼠行为学观察结果

空白组大鼠昼夜节律及饮食、饮水量正常，行为活动正常，大小便变化不明显，毛发光泽；与空白组比较，造模组大鼠注射PCPA混悬液后出现昼夜活动不停，饮食量显著减少，饮水量显著增多，昼夜节律消失，互相攻击，对外界各种刺激敏感度提高，毛发光泽度差，笼内垫料较潮湿，粪便颜色变浅、质地较软；与模型组比较，各针刺组于治疗第3日开始恢复昼夜节律，饮食量较前递增，饮水量较前递减，粪便颜色恢复正常黄褐色，质地较前变硬。

2.4 针刺对失眠大鼠下丘脑腹外侧视前区褪黑素含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠VLPO区MT含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，各针刺组大鼠VLPO区MT含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与非经非穴组比较，百会+神门组大鼠VLPO区MT含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3。

2.5 针刺对失眠大鼠下丘脑腹外侧视前区褪黑素受体1、2 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠VLPO区MT1、MT2 mRNA表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，各针刺组大鼠VLPO区MT1、MT2 mRNA表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与百会+神门组比较，百会+三阴交组、百会+非经非穴组大鼠VLPO区MT1、MT2 mRNA表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与百会+三阴交组比较，百会+非经非穴组大鼠VLPO区MT1、MT2 mRNA表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表4。

3 讨论

失眠属中医学“不寐”范畴。病因大致为脏腑阴阳失衡、饮食不节、情志失调、久病体虚等。病机虽复杂，关键在神失所主、心神不安。故其病位主要在心，且与脾、肾等密切相关。心藏神，外邪侵扰，神不守舍，阳不入阴故失眠；心主血脉，心血亏虚、心神失养故不寐。脾主运化，主统血，脾气生化无源，心失气血濡养可致不寐，《素问·厥论篇》“太阴之厥，则腹满胀，后不利，不欲食，食则呕，不得卧”；脾主思，思虑过度致气结或气滞，亦可形成不寐，《类证治裁》所论“思虑伤脾，脾血亏损，经年不寐”。肾主水，为先天之本，肾中真元不足，可致阳不入阴，神不安守，多表现为入睡困难、易醒早醒，《医法圆通》谓：“不卧一证……有因肾阳衰而不能启真水上升以交于心，心气即不得下降，故不卧。”头为诸阳之会，百会位于巅顶，为经脉之气会聚之处，具有醒脑开窍、镇静安神之功，杨上善说“胃流津液渗入骨空，变而为髓，头中最多，故为海也。是肾所生，其气上输脑盖百会穴，下输风府也”。“经脉所过，主治所及”，神门为心经原穴，有镇静安神功效，心安则能入眠。三阴交属足太阴脾经，为三阴经交汇处，调三经之气而使阴可敛阳。由此可知，以上3穴与失眠关系密切，本研究以百会作为固定按部选穴，各针刺组在此基础上分别配以不同经脉穴位，神门为本经穴，三阴交为他经穴，为说明循经选穴是否有特异性，另设百会+非经非穴作为对照，使实验设计更为合理。

MT分泌昼夜节律性与光照有关，由视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）控制，日光照射通过此结构抑制MT的分泌，因此夜间MT分泌明显升高[13]。MT有3个受体，分別为MT1、MT2和MT3，其广泛存在于神经系统下丘脑SCN、海马、小脑皮质、前额叶、基底节，以及视网膜、血管、乳腺、肝、肾和胃肠道等系统的细胞膜和细胞核内。研究发现与睡眠有关的是MT1和MT2，MT通过与MT1和MT2作用来调节睡眠、恢复昼夜节律、提高睡眠质量，改善身体的机能，提高生活质量[14]。针灸是治疗失眠的有效方法，因其疗效确切且不良反应少而广泛应用。有研究发现，针刺可显著改善大鼠睡眠-觉醒昼夜节律紊乱，其机制可能与其对血清MT水平及节律的调节有关[15]。本实验采用经典的PCPA造模方法建立失眠大鼠模型，结合戊巴比妥钠睡眠实验，通过观察大鼠睡眠时间和生理指标的变化确定造模成功。与模型组比较，各针刺组大鼠经治疗后VLPO区MT含量及MT1、MT2 mRNA表达明显升高，且均为百会+神门组优于其余2组。以上数据结果与其表现出的昼夜节律、兴奋性、纳食进水量等生理指标的变化有一定程度的吻合，表明针刺治疗失眠的疗效确切，其改善睡眠的机制可能是通过调节失眠大鼠VLPO区MT含量及MT1、MT2 mRNA的表达实现的。

综上，腧穴配伍不同，其疗效也各异，本实验通过固定取穴（“百会”），再分别配以不同经脉腧穴（心经穴、脾经穴、非经非穴），比较本经穴、他经穴、非经非穴的疗效差异。根据实验结果，神门可作为临床治疗失眠的必要穴位，三阴交可作为符合辨证的首选穴位。同时表明，MT及其受体与睡眠有密切的关系，循经选穴针刺是腧穴配伍效应的影响因素之一。

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