刺山柑总生物碱对系统性硬皮病小鼠WNT通路相关蛋白表达的影响

阿依提拉·麦麦提江 卢军 姜林 康小龙 杨晓迷 孟瑶

摘要：目的 觀察刺山柑总生物碱对系统性硬皮病（SSc）小鼠组织纤维化密切相关的WNT通路中WNT1、WNT2、Dickkopf相关蛋白2（DKK2）和分泌型卷曲相关蛋白1（SFRP1）表达的影响，探讨其对SSc WNT通路的调控作用机制。方法 小鼠皮下注射博莱霉素4周复制SSc模型。90只BALB/c小鼠随机分为正常组、模型组、青霉胺组和刺山柑总生物碱组低、中、高剂量组，受试药组小鼠背部外敷刺山柑总生物碱乳膏，青霉胺组给予青霉胺灌胃，正常组和模型组小鼠背部外敷不含药乳膏基质，每日1次，连续8周。HE染色观察小鼠皮肤组织病理形态，ELISA检测小鼠皮肤组织WNT1、WNT2及血清DKK2、SFRP1的蛋白表达。结果 与正常组比较，模型组小鼠皮肤出现明显炎症与纤维化的病变，WNT1、WNT2表达明显升高，DKK2表达明显降低（P<0.01）；与模型组比较，刺山柑总生物碱中、高剂量组小鼠皮肤炎症和纤维化均减轻，WNT1、WNT2表达明显降低，DKK2表达明显升高（P<0.05，P<0.01），对SFRP1水平无明显影响（P>0.05）。结论 刺山柑总生物碱可能通过下调SSc小鼠WNT1、WNT2表达和上调DKK2表达，对SSc小鼠WNT通路有一定抑制作用。

关键词：刺山柑总生物碱；系统性硬皮病；WNT1；WNT2；Dickkopf相关蛋白2；分泌型卷曲相关蛋白1；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.014

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）12-0053-04

Abstract： Objective To explore the effects of capparis spinosa total alkaloid on WNT1， WNT2， Dickkopf-related protein 2 （DKK2） and secreted frizzled-related protein 1 （SFRP1） levels； To explore its mechanism of regulation of systemic sclerosis （SSc） WNT pathway. Methods Subcutaneous injection of bleomycin was injected in mice for 4 weeks to replicate the SSc model. Totally 90 BALB/c mice were randomly divided into control group， model group， penicillamine group and capparis spinosa total alkaloid low-， medium- and high-dose groups. Mice in medication groups received external application with capparis spinosa total alkaloid cream； mice in penicillamine group were given penicillamine for gavage； mice in the control and model group received external application without substance， once a day for 8 weeks. The pathological change of skin tissue was observed by HE staining， and the protein expressions of WNT1， WNT2 in skin tissue， and DKK2， SFRP1 in serum were detected by ELISA. Results Compared with the control group， the inflammation and fibrosis of skin tissue were severe， and the expressions of WNT1 and WNT2 increased and DKK2 decreased markedly in model group （P<0.01）. Compared with the model group， the inflammation and fibrosis of skin tissue were improved， and the expressions of WNT1 and WNT2 decreased and DKK2 increased markedly in capparis spinosa total alkaloid medium- and high-dose groups （P<0.05， P<0.01）. But the level of SFRP1 was not influenced （P>0.05）. Conclusion Capparis spinosa total alkaloid can inhibit the WNT pathway of SSc mice by down-regulating the expressions of WNT1，WNT2 and up-regulating the expression of DKK2 in SSc mice.

Keywords： capparis spinosa total alkaloid； systemic sclerosis； WNT1； WNT2； dickkopf-related protein 2； secreted frizzled-related protein 1； mice

系统性硬皮病（systemic sclerosis，SSc）是一种结缔组织疾病，表现为过量胶原在皮肤、肺、消化道等内脏器官沉积，以皮肤和内脏器官纤维化为特征[1-2]。本课题组从新疆地产药材刺山柑Capparis spinosa L.中提取有效成分刺山柑总生物碱用于SSc的治疗。前期研究表明，刺山柑总生物碱可明显降低SSc小鼠真皮厚度，减少皮肤组织羟脯氨酸及Ⅰ、Ⅳ型胶原合成，改善SSc组织纤维化，其作用可能与调节基质金属蛋白酶-9/基质金属蛋白酶抑制剂-1失衡，减少白细胞介素-4异常表达，调节白细胞介素-4/干扰素-γ失衡有关[3-5]。本研究通过观察刺山柑总生物碱对SSc组织纤维化密切相关的WNT通路中WNT1、WNT2、Dickkopf相关蛋白2（DKK2）和分泌型卷曲相关蛋白1（SFRP1）表达的影响，探讨其对SSc WNT信号通路的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雌性BALB/c小鼠90只，体质量18～22 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK（京）2016?0006。饲养于室温（21±2）℃、相对湿度35%～55%环境，光照明暗交替12 h/12 h，标准饲料常规喂养7 d。

1.2 药物及制备

刺山柑饮片，新疆麦迪森维药饮片厂，经新疆药物研究所何江研究员鉴定为正品。刺山柑加10 倍量95%乙醇，80 ℃水浴加热提取2次，每次30 min，提取物浓缩干燥，得刺山柑总生物碱，总生物碱经紫外分光光度法测定，含量>32%。盐酸博莱霉素注射剂，海正辉瑞制药有限公司，批号17001711；青霉胺片，上海上药信谊药厂，批号052160901。

1.3 主要试剂与仪器

小鼠WNT1、WNT2、DKK2和SFRP1 ELISA试剂盒，武汉华美生物工程有限公司。酶标仪、低温离心机，美国Thermo Fisher公司。

2 实验方法

2.1 分组、造模和给药

90只BALB/c小鼠采用随机数字表法分为正常组、模型组、青霉胺组（125 mg/kg）和刺山柑总生物碱低（225 mg/kg）、中（450 mg/kg）、高（900 mg/kg）剂量组，每组15只。博莱霉素皮下注射法建立SSc模型[6-7]：将小鼠背部中央区被毛剃除，盐酸博莱霉素粉针剂用生理盐水配成浓度为300 μg/mL的药液，除正常组背部皮下注射生理盐水外，其余各组注射博莱霉素，30 μg/d，注射4周后，刺山柑总生物碱乳膏外敷各受试组小鼠背部，阳性药组予青霉胺灌胃，其余组外用不含药基质，每日1次，连续8周。

2.2 切片制作

给药8周后，取小鼠背部注射区皮肤，10%福尔马林固定，HE染色制作切片，观察病理改变。

2.3 WNT1和WNT2蛋白表达测定

给药8周后，取小鼠背部皮肤，加生理盐水，组织匀浆机研磨成匀浆，浓度为10%，4000 r/min离心10 min，取上清液。采用ELISA测定WNT1和WNT2蛋白表达，以每毫升上清液中总蛋白含量（二辛可宁酸蛋白定量试剂盒测定）校正ELISA结果。严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.4 Dickkopf相关蛋白2和分泌型卷曲相关蛋白1表达测定

给药8周后，取血，分离血清，采用ELISA试剂盒测定DKK2和SFRP1表达。严格按照试剂盒说明书进行操作。

3 统计学方法

采用SPSS11.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析，组间比较用SNK-q法。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 病理变化

模型组较正常组皮肤明显增厚，胶原纤维增生，毛囊、皮脂腺明显减少，脂肪层变薄、消失，血管闭塞，真皮下层血管增粗，血管壁明显变薄，出现不同程度炎性细胞浸润；刺山柑总生物碱中、高剂量组和青霉胺组较模型组真皮鳞状上皮变薄，胶原纤维呈均质化、排列疏松，数量明显减少，皮脂腺增多，炎性细胞浸润减轻。见图1。

4.2 刺山柑总生物碱对模型小鼠皮肤组织WNT1、WNT2表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠皮肤组织WNT1、WNT2表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组WNT1表达明显降低，刺山柑总生物碱高、中剂量组WNT2表达明显降低（P<0.05，P<0.01），刺山柑总生物碱各剂量组与青霉胺组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、表2。

4.3 刺山柑总生物碱对模型小鼠血清Dickkopf相关蛋白2表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清DKK2表达明显降低（P<0.01）；与模型组比较，刺山柑总生物碱中剂量组和青霉胺组DKK2表达明显升高（P<0.05，P<0.01），刺山柑总生物碱各剂量组与青霉胺组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

4.4 刺山柑总生物碱对模型小鼠血清分泌型卷曲相关蛋白1表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清SFRP1表达升高，差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，各给药组小鼠血清SFRP1表达降低，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

5 讨论

SSc是一种表现为多组织炎症和纤维化的慢性自身免疫性疾病，目前认为SSc病因是由于过度活化的成纤维细胞（Fb）合成胶原、纤维连接蛋白和糖胺聚糖等增多，细胞外基质（ECM）沉积，引发组织纤维化[8-9]。研究显示，SSc患者Fb增殖及Ⅰ型胶原的合成增加等病理改变可被刺山柑乙醇提取物抑制[10]；硬皮病小鼠真皮增厚、胶原沉积可被刺山柑流浸膏显著抑制[11]；刺山柑乙酸乙酯和乙醇提取部位能使增厚的硬皮病小鼠真皮变薄，Ⅰ型胶原及转化生长因子-β1的过表达被抑制[12]。与上述研究结果一致，本实验发现刺山柑总生物堿可明显减轻SSc小鼠皮肤纤维化等病理改变。

WNT信号通路在人体器官发展和各内部组织平衡中起着关键作用。有研究表明，WNT信号通路在肝、肾、肺、皮肤等器官纤维化进程中起到了重要作用，尤其在Fb的增殖及向肌成纤维细胞（MFb）的分化中起着调控作用[13]。经典的WNT通路包括10个WNT受体和19个WNT配体 ，WNT1和WNT2是该通路的起始蛋白，WNT受体与配体的结合被几个WNT抑制剂如DKK、SFRPs所抑制，防止经典WNT信号通路的激活[14-15]。有研究表明，在SSc皮肤和肺组织Fb中经典WNT信号通路被激活，并且发现WNT1水平升高，DKK2水平降低，导致目标基因转录增加，引起SSc组织纤维化[16-18]。在SSc动物模型如博莱霉素诱导的皮肤纤维化和紧皮鼠（Tsk-1鼠），WNT信号通路被病理性激活并诱导Fb活化和ECM合成增加[13，17]。在体外，重组WNT蛋白可刺激Fb的活化和ECM合成增加[14，16]，WNT2基因在SSc模型小鼠皮损表达明显升高，并与纤维蛋白mRNA的高表达具有一致性，故WNT2过表达使Fb转分化为MFb，过度合成ECM，引起SSc皮肤纤维化[18-19]。本研究发现，模型组小鼠皮肤组织WNT1、WNT2表达明显升高，血清DKK2表达降低，与上述研究结果一致；450、900 mg/kg刺山柑总生物碱可明显降低WNT1、WNT2表达，升高DKK2表达，提示刺山柑总生物碱可能通过抑制SSc WNT通路的异常激活，增加WNT抑制剂DKK2表达，抑制WNT受体与配体的结合，改善SSc组织纤维化。

参考文献：

[1] 李晶冰，张彩萍，季江，等.阿维A对系统性硬皮病成纤维细胞胶原合成及Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响[J].中国麻风皮肤病杂志，2014，30（7）：397-399.

[2] 闫小宁，张建荣，李文彬，等.温阳除痹汤对硬皮病模型小鼠CTGF的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2013，12（1）：13-16.

[3] 康小龙，何承辉，田红林，等.刺山柑总生物碱乳膏外用对系统性硬皮病小鼠组织纤维化的改善作用[J].中国现代应用药学，2016，33（1）：32- 35.

[4] 康小龙，刘晶，何承辉，等.刺山柑总生物碱对系统性硬皮病小鼠基质金属蛋白酶及其抑制剂的影响[J].中国中医药信息杂志，2016，23（3）：51-53.

[5] 何承辉，康小龙，刘晶，等.刺山柑总生物碱对系统性硬皮病小鼠血清白细胞介素-4、白细胞介素-13和干扰素-γ的影响[J].中国中医药信息杂志，2016，23（8）：77-79.

[6] WU T， CHU H， TU W， et al. Dissection of the mechanism of traditional Chinese medical prescription-Yiqihuoxue formula as an effective anti-fibrotic treatment for systemic sclerosis[J]. BMC Complement Altern Med，2014，14（1）：224-234.

[7] HAO Z F， SU Y M， LIU J Y， et al. Astragalus polysaccharide suppresses excessive collagen accumulation in amurine model of bleomycin-induced scleroderma[J]. Int J Clin Exp Med，2015，8（3）：3848-3854.

[8] BEYER C， DISTLER J H. Morphogen pathways in systemic sclerosis[J]. Curr Rheumatol Rep，2013，15（1）：299-306.

[9] FANG F， OOKA K， SUN X， et al. A synthetic TLR3 ligand mitigates profibrotic fibroblast responses by inducing autocrine IFN signaling[J]. J Immunol，2013，191（6）：2956-2966.

[10] 曹越兰，李欣，郑敏.槌果藤对进行性系统性硬化症患者成纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原产生的影响[J].中国中药杂志，2008，33（5）：560-562.

[11] 曹越兰，李欣，王群.槌果藤对硬皮病小鼠模型皮肤硬化抑制作用的实验研究[J].中国中药杂志，2008，33（2）：215-217.

[12] 李凡，赵娜，华伟，等.槌果藤乙醇提取物对体外培养的人皮肤成纤维细胞生长的影响[J].中国皮肤性病学杂志，2009，23（8）：475-477.

[13] AKHMETSHINA A， PALUMBO K， DEES C， et al. Activation of canonical Wnt signalling is required for TGF-beta-mediated fibrosis[J]. Nat Commun，2012，3：735.

[14] BEYER C， DISTLER J H. Morphogen pathways in systemic sclerosis[J]. Curr Rheumatol Rep，2013，15（1）：299-306.

[15] DEES C， SCHLOTTMANN I， FUNKE R. The Wnt antagonists DKK1 and SFRP1 are downregulated by promoter hypermethylation in systemic sclerosis[J]. Ann Rheum Dis，2014，73（6）：1232-1239.

[16] BEYER C， SCHRAMM A， AKHMETSHINA A， et al. Beta-catenin is a central mediator of pro-fibrotic Wnt signaling in systemic sclerosis[J]. Ann Rheum Dis，2012，71（5）：761-767.

[17] WEI J， MELICHIAN D， KOMURA K， et al. Canonical Wnt signaling induces skin fibrosis and subcutaneous lipoatrophy：a novel mouse model for scleroderma？[J]. Arthritis Rheum，2011，63（6）：1707- 1717.

[18] WEI J， FANG F， LAM A P， et al. Wnt/beta-catenin signaling is hyperactivated in systemic sclerosis and induces Smad-dependent fibrotic responses in mesenchymal cells[J]. Arthritis Rheum， 2012，64（8）：2734-2745.

[19] BEYER C， REICHERT H， AKAN H， et al. Blockade of canonical Wnt signaling?ameliorates experimental dermal fibrosis[J]. Ann Rheum Dis，2013，72：1255-1258.