探讨术中冰冻各环节的注意事项和应用体会

吴鹏

（浙江省肿瘤医院病理科 浙江 杭州 310022）

利用冰冻切片技术对送检标本进行术中诊断已经普遍应用于外科手术的快速病理诊断。自1960年Cryostat冰冻切片机应用以来，目前国内外临床通过术中冰冻诊断来决定下一步的手术方式及手术范围，已经成为外科手术的重要方式[1]。而随着病理从业人员素质的提高和冰冻切片设备的更新换代，冷冻切片质量和常规石蜡切片差别越来越小，病理医生对术中冰冻切片诊断的准确率也得到了提高[2-4]。而伴随着诊疗技术的不断发展，各临床科室对术中冰冻的要求也越来越高。基于此，就需要我们对冰冻切片各个环节进行系统性探讨，总结一些影响冰冻切片质量的因素和注意事项。来提高切片质量以利于病理诊断和临床诊疗方案的选择。

1.材料与方法

1.1 材料

本院外科手术送检组织标本涉及甲状腺、肝脏、宫颈、乳腺、卵巢、肺、脑、淋巴结及各类切缘等。所有标本均及时新鲜送检，不加任何处理。

1.2 设备及耗材

采用Thermo恒温冰冻切片机；医用超声耦合剂（KL-250型，杭州凯普乐医疗器械有限公司）[5]；Thermo MX35一次性刀片。

1.3 试剂

甲醇固定液[6]；改良Gill苏木素染液[7]；醇溶性伊红染液；促蓝液；脱水用梯度酒精；二甲苯。

1.4 方法

1.4.1 取材 送检手术标本取材对制片的影响非常重要，不但要求及时、规范。还要注意几点事项：（1）送检标本必须无固定，不经任何液体浸泡。（2）取材台面必须保持干净，避免污染。（3）取材刀要锋利，避免挤压组织。（4）取材刀，剪，镊子保持干净，每次取材后洗净，擦干。（5）组织大小厚薄适宜（1.5cm×1.5cm×0.3cm），冰冻取材可略厚（0.3～0.4cm）[8]。（6）送检标本遇有较多血液和液体时要充分吸干，避免冰晶形成[9]。（7）取材时尽量剔除不相关的部分（脂肪，毛发，线结，骨组织及钙化）

1.4.2 包埋 根据组织大小在冷冻头上涂上医用超声耦合剂，将取材后最利于诊断的切面朝上放置，并马上置于速冻台上速冻，同时使用冷冻锤压置。实践证明，使用冷冻锤压置标本既可以加快冷冻速度，减少冰晶的出现[10]。还可以压平标本切面，有利于切出标本最大面。注意事项：（1）耦合剂略多于组织，能将组织包裹住为宜。（2）冷冻锤要轻拿轻放。（3）速冻是防止冰晶形成的有效方法。

1.4.3 切片 待新鲜组织快速冷冻后将冷冻头移至冻头夹，缓慢后退冻头至合适距离开始修片，修片过程动作要轻柔，不可过快修片，以免组织脱落或损坏刀口。调整好防卷板位置，确认切片厚度，开始切片。切出一张平坦无折褶的薄片后，快速粘附于载玻片上。（1）切片刀要锋利。（2）厚度一般以4～5μm为宜，脂肪组织可为10～15μm（见表1）。（3）淋巴结、肝等细胞丰富的组织在过冻发裂的情况下，可用手敷使其回温后再行切片。（4）在使用防卷板的情况下仍无法顺利出片的情况下，可用毛笔协助拉片。（5）粗修后要细切掉前面几张，避免切片出现孔隙。（6）转动冰冻机手柄要用力均匀，切忌猛修猛切。

冰冻切片的温度、时间控制是切片好坏非常关键的一步。应根据组织的大小、厚薄、种类来确定冷冻的时间。但是在实际工作中，由于送检标本数较多，频繁调试冰冻切片机的温度不切实际，故一般在室温较高时将冰冻切片机箱体温度设为-25℃左右[8]，在室温较低时将切片机箱体温度调至-20℃左右。速冻台设置速冻温度-35℃～-50℃。冻头温度应根据组织情况来设置，一般设置在-20℃左右。

表1 常见组织冻头温度，冷冻时间，切片厚度建议

1.4.4 固定及染色 将粘附有薄切片的载玻片快速放入甲醇液中固定，不洗直接浸入苏木素染液1～1.5分钟，水洗后促蓝液蓝化充分水洗，入伊红染色5～10秒，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。（1）固定液经常更换，固定时间要充足，尤其是细胞成分丰富的组织。（2）最好使用新鲜苏木素染液。（3）室温过低时，最好加温苏木素染液再进行染色[11]。（4）促蓝液蓝化后水洗要充分，防止伊红着色欠佳。（5）切片呈云雾状时要按顺序返回到低浓度酒精重新脱水透明封固。

2.结果

针对不同组织在制片过程中的注意事项，制作出的切片切面平坦完整 ,厚薄均匀、无皱折，镜下组织结构完整，细胞形态清晰，染色鲜艳，细胞质与细胞核红蓝对比明显，细胞无明显肿胀和收缩，无空泡，无人为裂隙及无冰晶等。镜下观察的细胞形态能完整地呈现，类似于常规石蜡切片，层次分明，分辨率良好。（图1）

图1 细胞形态清晰，染色鲜艳，对比度好，类似于常规石蜡切片

3.讨论

术中冰冻的目的是要求在短时间内作出准确的病理诊断，帮助外科医生确定病变的性质，决定手术的方式和范围。冰冻切片的原理是在低温条件下使组织快速冷冻至一定硬度，然后进行切片的方法。其制作过程较常规石蜡切片快速、简便。目前已经广泛应用于临床手术中。所以要快速完成一张高质量的冰冻切片非常重要，各个环节要注意的细节也很多，从取材、包埋到切片、固定、染色等过程。针对不同组织要选择不同的温度、时间及厚度，其中冷冻温度和时间的控制是非常关键的。不同组织应该选用不同的技巧，不可一概而论。但是想要做好一张冰冻切片并非易事，这需要病理技术人员具有严谨的工作态度、仔细的工作作风和长期的练习和摸索。对每一例送检的病理标本都要严谨、仔细的进行制作。在制片工作中做到每一个环节都能精于求精。并要求能在工作之余进行总结和经验积累，从而提高自身的业务水平，为病理诊断及临床应用提供更好的保障。