黑碳诱发蚕豆根尖细胞不同分裂时期的遗传毒性效应

李奥, 尚梦婷， 木魁, 姜双林

(1. 阜阳市第一中学, 阜阳 236000; 2. 阜阳师范学院 生物与食品工程学院, 阜阳 236037)

黑碳(Black carbon, BC)是由化石燃料和生物质不完全燃烧产生的一种含碳的、高度芳香化的多孔高聚混合物，主要由元素碳(element carbon, EC)和少量的有机碳(organic carbon, OC)组成[1]。典型黑碳的形貌是球形小粒子，粒径为0.01～1.0 μm。黑碳是大气细颗粒物(PM2.5，又称可入肺颗粒物)主要化学成分之一，我国黑碳颗粒的排放约占全球排放总量的四分之一[2]。研究表明，在构成我国PM2.5的黑碳组分中，其中黑碳颗粒83%来自化石燃料和生物质燃烧[3]。黑碳粒子具有发达的孔隙和比表面积大等特点，黑碳在气-粒传输和非均相光化学反应中，能吸附大气中多种有毒有害物质(如有机物和重金属)，并能催化其化学反应形成了二次黑碳粒子，诱发严重的呼吸系统和心血管系统等疾病[3-4]。

研究表明，亚微米级(0.01～1.0 μm)的黑碳粒子很容易进入呼吸道并突破气血屏障进入血液循环，能够诱发机体产生一系列的炎症反应，其诱发炎症的作用机理主要有免疫细胞损伤、DNA的损伤和氧化应激等[3]。研究不同粒径的黑碳颗粒悬浮液对小鼠肺泡巨噬细胞有明显的毒性作用，并诱发小鼠产生急性炎症反应。不同剂量的黑碳颗粒物(粒径0.1～1.0 μm)与大鼠肺泡巨噬细胞体外共培养的结果显示，随着黑碳浓度的增加，大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率明显上升。研究发现，黑碳暴露能诱发人上皮细胞氧化应激反应，发现随着暴露时间延长和黑碳剂量的增加，炎症因子(IL-6、IL-8和TNF-α)基因表达量增强[5-6]。另外，郜鑫等研究了黑碳诱发小鼠的遗传毒性，发现急性暴露于高剂量黑碳处理的小鼠体内氧化应激水平升高，并出现了小鼠骨髓细胞遗传损伤效应[7]。

蚕豆体细胞具有6对大型染色体，采用蚕豆根尖微核实验技术进行毒理学研究，具有操作简便、检测灵敏和快速等优点，与动物毒理学实验结果相比较具有较高的一致性[8-9]。目前，蚕豆根尖微核实验是国际上常用的环境化学物质毒性检测技术，已经被联合国环境署(UNEP)、世界卫生组织(WHO)、美国环境保护署(US-EPA)和我国环保部列为环境毒理测试的技术规程，在国内外环境化学物质毒性检测中得到了普遍的运用[10-12]。因此，蚕豆根尖微核技术是环境毒理中常用的植物检测体系，用来检测环境中有毒有害物质的遗传毒性效应[13-15]。本研究以蚕豆根尖为实验材料，探讨黑碳对蚕豆根尖细胞微核和有丝分裂的影响，以评价黑碳的细胞遗传毒性，为黑碳颗粒物的环境毒理学研究提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 材料

蚕豆(Viciafaba) 种子(品种为崇礼蚕豆)，购于阜阳市绿丰种子公司。黑碳1864(CAS：7440-44-0)，购自Aladdin公司，分子量12.01，比表面积为165.5 m2/g，pH 7.5，粒径小于0.01 μm，黑碳颗粒呈球状颗粒物。准确称取黑碳用蒸馏水溶解配制母液，然后用蒸馏水稀释配制0、10、20、40、80、160和320 mg/L的浓度梯度供试。无水酒精、冰醋酸、碱性品红、苯酚、甲醛和盐酸等化学药品均为分析纯。

1.2 试剂

卡诺氏固定液(Carnoy′s Fluid)按照无水酒精与冰醋酸(3∶1)的比例配制；水解分离液按照盐酸与95%酒精(1∶1)的比例配制。均保存4℃备用。

改良苯酚品红染液配制：将3.0 g碱性品红溶解于100 mL 70%乙醇中，按照1∶9的比例将其与5%苯酚溶液混合，即得母液。将45 mL母液，6 mL 37%甲醛，6 mL冰醋酸混合均匀。保存4℃备用。

1.3 实验仪器

OLYMPUS光学生物显微镜、日光培养箱和发芽盒等。

1.4 方法与步骤

1.4.1 种子处理

选用籽粒饱满大小一致的蚕豆种子浸泡于蒸馏水中，置于温度25℃的培养箱中24 h，种子吸胀用湿纱布包裹放入垫有湿脱脂棉的发芽盒中，在25℃培养箱中催芽，当蚕豆种子的初生根长至2 cm左右时，选取根尖发育良好的蚕豆，用于检测黑碳的诱变效应。

1.4.2 染毒与修复

用蒸馏水，将黑碳储备液配置为0、10、20、40、80、160和320 mg/L，共 7个浓度梯度，在每个浓度中加根尖发育良好的5粒蚕豆种子，根尖完全浸入药液中染毒48 h。染毒结束后，用蒸馏水冲洗3次(每次1 min左右)，待药液冲洗干净后再用蒸馏水对根尖修复培养24 h。

1.4.3 固定与解离

在10 mL试管中加5 mL卡诺氏固定液，剪取经过药液处理长约0.5 cm的根尖10条，25℃温度下固定24 h，用95%酒精冲洗根尖，至不含冰醋酸为止。然后转移至70%酒精中保存4℃备用。

将已固定好的根尖转移到10 mL的试管之中，加水解分离液2 mL，25℃温度下处理15 min；倒出解离液后，再加固定液2 mL放置5 min左右使蚕豆根尖软化。倒去固定液后，用蒸馏水反复冲洗蚕豆根尖呈白色微透明。

1.4.4染色与压片

取蚕豆根尖放于洁净的载玻片上用刀片纵横切成数段，采用十字压片法压片，使根尖细胞充分分散。在载玻片一侧滴1～2滴改良苯酚品红染液，染色20～30 min，吸去多余的苯酚品红染液。

1.4.5 镜检

每个处理浓度镜检3～5条蚕豆根尖，每条根尖镜检约1000个细胞，观察统计根尖细胞有丝分裂的细胞数、分裂期的细胞数、染色体畸变的细胞数和微核数。参考段昌群等[9]的方法识别蚕豆根尖细胞微核，细胞有丝分裂指数参照仪慧兰等[11]的方法计数。按照下述公式统计：

有丝分裂指数(%)= (分裂期细胞数/细胞总数)×100%

微核率(%)=(微核细胞数/细胞总数)×1000‰

多核仁率(%)=(多核仁细胞数/观察细胞数)×100%

1.5 数据处理

实验数据应用DPS数据处理平台(唐启义和冯明光，2002)进行方差分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 黑碳对蚕豆根尖细胞微核的影响

图1显示了黑碳对蚕豆根尖细胞微核的影响，结果表明在10、20和40 mg/L的低浓度下，根尖细胞微核率有所增加，但与对照(CK=0 mg/L)相比较无显著性差异(P>0.05)，表明黑碳在低浓度下，黑碳不会明显诱发根尖细胞的微核率。在黑碳浓度达到80、160和320 mg/L时，细胞微核率分别依次为13.8‰、29.7‰和38.9‰，与CK相比微核率产生了显著差异(P<0.05)。黑碳的浓度与蚕豆根尖细胞微核率之间的相关回归方程为y=1.542 9x2-6.278 6x+7.771 4相关系数R2=0.983 4，表明黑碳浓度与根尖细胞的微核率之间相关性强，显示出明显的剂量效应。

*表示黑碳处理组和蒸馏水对照组差异显著(P<0.05)；下同

图1不同浓度黑碳对蚕豆根尖细胞微核的影响

Fig 1 Effects of various black carbon concentrations on
micronucleus ratio ofV.fabaroot tip cells

2.2 黑碳对蚕豆根尖细胞有丝分裂的影响

黑碳对蚕豆根尖细胞有丝分裂有明显的影响，结果见表1。从根尖细胞有丝分裂指数可以看出，蚕豆根尖经过不同浓度的黑碳染毒处理后，根尖细胞的有丝分裂指数与对照相比较均有不同程度的下降。在10～40 mg/L浓度时有丝分裂指数与对照没有显著性差异(P>0.05)；在80～320 mg/L浓度时有丝分裂指数与对照相比较有显著的差异(P<0.05)。当黑碳浓度为320 mg/L时，细胞有丝分裂指数仅为2.051 1%；中期、后期和末期细胞分裂指数均为0，表明中期、后期和末期细胞出现的频率与对照相比较明显减少。同时，根尖细胞压片观察发现细胞变形，细胞质有解体的现象，而且对末期分裂指数的影响最显著，在低浓度20 mg/L时，与对照之间的差异达到了显著水平，有丝分裂指数为1.075 8%。

表1 黑碳对蚕豆根尖细胞有丝分裂的影响

2.3 黑碳诱发蚕豆根尖细胞的多核仁现象

从图2中可知，不同浓度的黑碳处理后，诱发细胞核分裂出现异常，主要表现为多核仁现象。在10～40 mg/L浓度时核分裂异常率与对照没有显著性差异(P>0.05)；在80～320 mg/L浓度时，核分裂异常率与对照相比较有显著的差异，尤其是20 mg/L浓度处理多核仁率为35.9%，与对照相比达到极显著差异水平(P<0.01)。黑碳的浓度与细胞多核仁率之间的相关回归方程为y=0.000 3x2+0.024 9x+1.402 6，相关系数R2=0.978 3，表明黑碳处理诱发根尖细胞有丝分裂受到阻滞的同时，细胞核分裂异常也出现较明显的剂量效应。

图2 不同浓度黑碳对蚕豆根尖细胞多核仁率的影响

3 讨论

微核(micronucleus)是由外界有毒有害等化学因子诱导细胞染色体断裂或丢失，在胞浆中形成 1 个或数个小核。微核的发生率与染色体的变异率有密切的关系，所以微核率是评价染色体损伤的主要指标之一。蚕豆(Viciafaba)根尖细胞微核技术在环境污染物、农药和化学品等生物安全性检测中得到了广泛应用[9,12,14-16]。前人的研究表明，环境污染物诱发的遗传毒性产生于细胞分裂间期的DNA和染色体的复制合成过程中[10,14-15]。这种毒性效应在细胞学标志就是细胞分裂中形成微核，微核的产生和细胞的分裂异常密切相关，说明微核现象的发生频率能够反映化学毒性物质诱发的细胞遗传物质的受损伤程度[15,17-19]。

本实验结果表明，当黑碳浓度上升到80 mg/L时，黑碳诱发的蚕豆根尖细胞的有丝分裂指数的下降和微核率的增加与对照进行比较均达到了显著差异；而伴随着细胞有丝分裂指数的下降，微核率的增加出现了降低的趋势，表明细胞有丝分裂水平与微核率两者之间存在着相关性。黑碳诱发的蚕豆根尖细胞微核率的变化幅度明显高于有丝分裂指数和多核仁率，提示黑碳诱发的蚕豆根尖细胞的微核要比有丝分裂敏感。同时，对根尖细胞的微核现象进行镜检时更加直观可靠，所以在黑碳诱发的细胞毒性实验中以微核率作为指标具有明显的优势。黑碳可诱发蚕豆根尖细胞的微核率升高，在低浓度(10～40 mg/L)下，微核率与对照相比没有显著差异；但在高剂量(80～320 mg/L)下，微核率的差异达到显著水平，表明高浓度的黑碳对根尖细胞具有一定的遗传诱变性。我们在黑碳对人肺细胞(A549)的毒理实验中，观察到高浓度黑碳对A549细胞的增殖有显著的抑制效应。郜鑫等研究了黑碳诱发小鼠骨髓细胞的遗传损伤，但并没有以微核率作为指标[7]；不同学者用蚕豆根尖细胞检测化学品的微核试验结果出现的敏感性差异，可能与所用的化学材料和实验方法有一定的关系[8,11,19]。另外，本实验中观察到的黑碳能诱发蚕豆根尖细胞有丝分裂中出现核异常等现象。综合分析，黑碳在低浓度时的遗传毒性较低，在高浓度时具有一定的遗传毒性。