全成分葡萄汁对D-半乳糖诱导小鼠的抗衰老作用

王晓波，宋俊科，张 雯，于子茹，王海港，周启蒙，杜冠华

(中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所/北京市药物靶点研究与新药筛选重点实验室，北京 100050)

D-半乳糖诱导衰老模型是目前较常用的衰老动物模型，其衰老反应接近于自然衰老[1]。葡萄中含有丰富抗衰老作用的白藜芦醇等营养成分[2-5]，且主要存在于葡萄籽和葡萄皮中。本实验分别采用普通榨汁法和破壁法制备普通葡萄汁和全成分葡萄汁，应用HPLC-MS测定2种葡萄汁中化合物的含量，利用D-半乳糖、焦糊食物和单蒸水建立小鼠衰老模型，考察2种葡萄汁的抗衰老作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1供试品 巨峰葡萄，产地为河北。

1.1.2实验动物 小鼠80只，品系 KM，SPF级，雄性，体重33～35g，合格证号SYXK(京)2014-0023购买自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0002。饲养于筛选中心通风鼠笼，适应性饲养3d，观察小鼠状态良好后，开始实验。

1.1.3试剂 SOD、MDA和GSH-Px检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；D-半乳糖和PMSF，Sigma-Aldrich公司；蛋白裂解液、β-actin、Sirt1、Sirt6、p21、p53，CST公司；BCA蛋白定量试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒、Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG，康为世纪公司；蛋白Marker，Thermo Scientific公司。

1.2 实验仪器

JYL-Y8 PLUS营养破壁调理机(九阳，中国)；JYL-C051料理机(九阳，中国)；Agilent 1200高效液相色谱仪(Agilent，美国)；Agilent 6110单四级杆质谱仪(Agilent，美国)；Cascada TM LS water纯水仪(Pall，美国)；Spectra Max M5酶标仪(Molecular Devices，USA)；荧光倒置显微镜(Nikon，Japan)；XS105 DU电子天平(Mettler Toledo，Swiss)；Vortex Genie 2涡旋震荡仪(Scientific industries，USA)；MiniSpin常温离心机(Eppendorf，Germany)；全自动生化仪(Toshiba，Japan)；STT-2小鼠跳台仪、小鼠自主活动箱(中国医学科学院药物所)。

1.3 方法

1.3.1葡萄汁制备 全成分葡萄汁：准确称取洗净晾干的葡萄500g，加入250mL饮用水，放入营养破壁调理机中进行处理，转速H级，时间20 s/次，共4次。

普通葡萄汁：准确称取洗净晾干的葡萄500g，加入250mL饮用水，放入料理机中进行处理，默认转速，时间20 s/次，共4次。经过处理的葡萄汁以200目纱布进行过滤，获得无明显颗粒的葡萄汁，进行动物实验。

1.3.2普通与全成分葡萄汁离心后沉淀重量比较 取10mL离心管称重(W1)后加入5mL普通或破壁处理(全成分)的葡萄汁，称重并记录重量(W2)，以1 000r/min转速离心20min，吸取上清液，称取沉淀和管的重量(W3)。计算葡萄汁中固体沉淀物重量(W3-W1)。

1.3.3普通与全成分葡萄汁过200目筛后未滤过物重量比较 取1.5mL空EP管称重(W1)后向空EP管中加入500μL葡萄汁，称重并记录重量(W2)，再用移液枪吸出葡萄汁过200目筛至同一EP管中，称取EP管+滤过液体重量(W3)。计算未滤过物重量(W3-W2)。

1.3.4葡萄汁中化学成分检测液相质谱条件 色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(3.5μm，2.1mm×100mm)，柱温30℃，进样量为10μL，紫外检测信号288nm，流动相为含甲酸0.02%的水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱(表1)。

表1 梯度洗脱程序

质谱条件：质谱检测采用的离子源为电喷雾离子源(ESI源)，采用负离子检测模式，分别采用全扫描模式和单离子监测模式对潜在化合物进行预测。

质谱检测参数为Fragmentor = 150 V；Gain = 1.5；Drying Gas Flow = 10.0L/min；Nebulizer Pressure = 35 psig；Drying Gas Temperature = 350°C；Capillary Pressure = 3 000(positive)，3 000(negative)。单离子监测模式监测的m/z见表2。

表2 单离子监测模式检测的离子m/z和对应的目标化合物

1.3.5动物分组与给药 80只小鼠随机分为4组：正常对照组、模型组(衰老模型组)、普通葡萄汁组和全成分葡萄汁组。正常对照组动物每日皮下注射150mg/kg的生理盐水，给予常规饲料饲养，自由饮水；其余3组动物每日皮下注射150mg/kg的D-gal溶液[4]，同时给予单蒸水代替自来水、120℃烘焙12 h后的饲料代替普通维持饲料，连续7w[4]。于造模的第3周开始，每天小鼠禁水2 h后分别自由饮用自来水和不同葡萄汁6 h。

1.3.6小鼠体重、饮水量与形态观察 4组动物于每天给药前称重，记录体重、饮水量、葡萄汁饮用量和小鼠形态变化。

1.3.7自主活动测定 将小鼠放入自主活动仪活动箱中，测定前每只小鼠先适应环境1min，然后由记录仪自动记录3min内小鼠自发活动次数。

1.3.8跳台实验 跳台装置为l0cm *10cm *28cm的被动条件反射箱，四周为黑色塑料板、底面铺可通电的铜栅，每间内放置一高3cm、直径4cm的橡皮垫作为动物回避电击的安全区，先将小鼠放在反应箱内的橡皮台上适应3min，然后立即通以40V交流电，小鼠自开始至第1次跳下橡皮台的时间为潜伏期。小鼠跳下橡皮台，受到电击后逃避反应为跳上橡皮台。记录5min内小鼠跳下橡皮台后受到电击次数，称为错误次数。小鼠于实验开始前一天进行3次学习适应，24h后在底部铜栅通电情况下，直接将动物置于平台上，记录第1次跳下的潜伏期和5min内的错误次数。

1.3.9脏器指数的测定 取血后，取小鼠脑、肝、肾，取出后在生理盐水中清洗表面的血迹，吸水纸上吸干水分，称量重量并拍照，计算脏器指数。

1.3.10HE染色 每组取3只小鼠，用于肾脏病理检测：腹腔注射10%水合氯醛(3.5mL/kg)麻醉。依次剪开皮肤、胸腔，充分暴露心脏，以灌注针穿透心尖，进入左心室，朝主动脉方向插入，用蠕动泵(调整流速为65r/min)输注生理盐水，于右心耳下部剪开右心房，至流出液变清，换用4%多聚甲醛溶液继续灌注，至肝脏发白、动物全身僵硬为止，然后断头取脑，放入4%多聚甲醛溶液中继续固定24 h。石蜡包埋，将修整好的蜡块置于石蜡切片机上连续切片，片厚4μm，进行苏木素—伊红(HE)染色。

1.3.11小鼠肝组织SOD、GSH-Px和MDA含量 迅速剥离各组小鼠肾脏，预冷的生理盐水冲洗干净，制备10%肾脏匀浆，3 000r/min，4℃离心10min，取上清。测定肾脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性和丙二醛(MDA)含量。

1.3.12Western blot分析 Western blot法检测Sirt1、Sirt6和p21等蛋白表达变化，提取组织、细胞总蛋白或用细胞核与细胞浆蛋白抽提试剂盒分别提取细胞核蛋白和细胞浆蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。加入SDS上样品缓冲液，沸水浴10min，以同等蛋白含量进行SDS-PAGE电泳后转PVDF膜，然后用5% BSA室温封闭2 h，加入稀释后的一抗，4°C孵育过夜；TBST洗3次，每次10min；加入相应的二抗稀释液，室温孵育1 h，TBST洗3次，每次10min；用ECL发光法检测不同样品各种蛋白表达情况。

1.4 数据统计方法

实验结果以Mean ± SD表示，应用GraphPad Prism 6.0统计软件对各组数据进行处理，多组数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组间差异采用Tukey’s post hoc test计算，两组数据采用非配对t检验计算，P<0.05视为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 普通葡萄汁与全成分葡萄汁离心后沉淀物重量比较

由图1可知，全成分葡萄汁离心后沉淀物的重量较普通葡萄汁中沉淀物的重量低(P<0.01)，表明葡萄经破壁处理后有更多物质混悬到溶液中，导致其沉淀重量较轻。

图1 普通葡萄汁与全成分葡萄汁离心后沉淀物重量

2.2 普通葡萄汁与全成分葡萄汁过200目筛后未滤过重量比较

图2 普通葡萄汁与全成分葡萄汁过200目筛未滤过颗粒重量

由图2可知，经由200目筛过滤后，全成分葡萄汁未滤过颗粒重量明显轻于普通葡萄汁未滤过颗粒重量(P<0.05)，表明全成分葡萄汁中的颗粒物质明显少于普通葡萄中的颗粒物质，提示破壁处理得到的全成分葡萄汁更加细腻。

2.3 HPLC-MS法比较全成分与普通葡萄汁中化合物含量差别

2.3.1全成分与普通葡萄汁中白藜芦醇相对含量比较从图3A中可以明显看出，全成分葡萄汁中白藜芦醇的含量明显高于普通葡萄汁中白藜芦醇的释放量，2种葡萄汁中的白藜芦醇含量有显著差异(P<0.01)。

2.3.2全成分与普通葡萄汁中山奈酚的相对含量比较从图4A中可以明显看出，全成分葡萄汁中山奈酚的释放量远远高于普通葡萄汁中山奈酚的释放量(P<0.05)。

2.3.3全成分与普通葡萄汁中槲皮素的相对含量比较从图5A中可以明显看出，全成分葡萄汁中槲皮素的释放量远远高于普通葡萄汁中槲皮素的释放量(P<0.05)。

2.3.4全成分与普通葡萄汁中芦丁的相对含量比较从图6A中可以明显看出，全成分葡萄汁中芦丁的释放量显著低于普通葡萄汁中芦丁的释放量(P<0.01)，这一结果与笔者预期的结果相反，但考虑到芦丁属于黄酮与糖的结合物(黄酮苷)，因此，猜测可能是在全成分与普通处理过程中，芦丁可能脱掉糖分子，进而转化为苷元的结果。而全成分与普通处理过程芦丁转化为苷元的效率不同，造成了实验结果与预期结果相反。

2.4 小鼠葡萄汁饮用量统计

每天给予小鼠葡萄汁开始和结束时，使用量筒准确计量每组给葡萄汁的量，以体积表示，计算得出每只小鼠每天饮用葡萄汁量并比较两组差异。图7显示，两者在饮用量上无显著性差异(P>0.05)，表明葡萄汁所起的药效作用是相同剂量标准下的。

2.5 小鼠外观状态拍摄

造模及饮用葡萄汁7w后，对小鼠进行多方位拍摄，并观察小鼠外观及精神状态。从图8中可明显看出，正常组小鼠毛色光亮柔顺，精神状态良好，健康活泼好动。衰老模型组小鼠，毛色发暗、脏乱，且有毛发稀疏的现象。同时，模型组小鼠萎靡虚弱，四肢无力，呈趴伏蜷缩态且有弓背现象，出现了显著的衰老特征。全成分葡萄汁组小鼠与正常组小鼠基本相同，甚至更优于正常组。普通葡萄汁组小鼠的外观及状态介于正常组与模型组之间，说明葡萄汁对小鼠衰老模型所造成的外在状态有改善作用，且全成分组优于普通组。

2.6 小鼠体重变化

统计每周小鼠体重并记录，比较各组小鼠体重变化差异。从图9中可以看出，实验进行至第7周，随着造模的进行，各组小鼠体重均有稳定增长，增长到峰值后略有波动，但最终各组小鼠体重差异无统计学意义。衰老模型在体重衰减方面与对照组无显著性差异，给予葡萄汁也没有影响小鼠的体重指标。

图3 全成分与普通葡萄汁中白藜芦醇相对含量比较A葡萄汁中白藜芦醇含量；B白藜芦醇标准品的选择离子流色谱图；C全成分葡萄汁选择离子流色谱图；D普通葡萄汁选择离子流色谱图([M-H]-，m/z=227)

图4 全成分与普通葡萄汁中山奈酚相对含量比较A葡萄汁中山奈酚含量；B山奈酚标准品的选择离子流色谱图；C全成分葡萄汁选择离子流色谱图；D普通葡萄汁选择离子流色谱图([M-H]-，m/z=285)

图5 全成分与普通葡萄汁中槲皮素相对含量比较A葡萄汁中槲皮素含量；B槲皮素标准品的选择离子流色谱图；C全成分葡萄汁选择离子流色谱图；D普通葡萄汁选择离子流色谱图([M-H]-，m/z=301)

图6 全成分与普通葡萄汁中芦丁相对含量比较A葡萄汁中芦丁含量；B芦丁标准品的选择离子流色谱图；C全成分葡萄汁选择离子流色谱图；D普通葡萄汁选择离子流色谱图([M-H]-，m/z=609)

图8 小鼠外观状态

图10 小鼠自主活动实验结果

2.7 小鼠行为学改变检测

2.7.1小鼠自主活动 4组之间采取平行试验的方法，共4个暗箱，每次各取每组1只放入暗箱试验。从图10中可以看出，小鼠模型组自主活动与正常对照组相比显著减少(P<0.01)，全成分与普通组均可增加小鼠的自主活动数，且全成分组的自主活动数多于普通组。

2.7.2小鼠跳台实验 从图11A中可以看出，经过1d学习记忆之后，模型组与正常对照组相比潜伏期显著缩短(P<0.001)，给予葡萄汁组与模型组相比潜伏期有所增加，其中，全成分葡萄汁组对潜伏期变短的改善有着显著性的作用(P<0.05)。从图11B中可以看出，模型组与正常对照组相比犯错次数均增加(P<0.01)，给予葡萄汁组对犯错次数有改善作用，其中，全成分葡萄汁组与模型组相比改善作用有着显著性差异(P<0.05)。

2.8 小鼠肝、肾、脑脏器指数变化

取材时每只小鼠称量体重及肝、肾(两侧肾)、脑3种脏器重量，计算得每只小鼠不同脏器指数，统计并计算差异。组织器官的重量，特别是脑、肝、肾等重要器官的重量变化是反映机体衰老程度的重要指标。从图12A中可以看出，模型组小鼠与正常对照组相比，肝脏指数增加(P<0.001)，应为炎症或水肿、充血所致，而全成分与普通组均有改善作用，其中全成分组的改善作用有显著性(P<0.05)。各组小鼠肾脏器指数无明显差异(图12B)。另外，从图12C中可以看出，全成分组与普通组相比，脑脏器指数有显著性改善作用(P<0.05)。

2.9 小鼠肝脏组织抗氧化酶及氧化酶测定

SOD是一种存在于细胞液中的抗氧化酶，其活性的高低间接反映了组织抗氧化的能力[5]。从图13A中可以看出，与正常对照组相比，模型组肝组织中SOD活性降低，给予葡萄汁组对此均有改善作用，其中全成分组葡萄汁有着显著的改善作用(P<0.05)。GSH-Px是反映机体抗氧化能力的重要指标，进一步反映了小鼠衰老的情况。如图13B所示，与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织中GSH-Px活性降低，全成分组相对于模型组能显著提高GSH-Px水平(P<0.001)，并且全成分组的GSH-Px水平也显著高于普通组(P<0.001)。MDA是机体内的自由基引发脂质过氧化的一种产物，常被作为评价衰老的一种指标。如图13C，衰老模型组小鼠相对正常对照组MDA含量显著增高(P<0.001)，全成分葡萄汁组相对于模型组可以显著降低MDA的含量(P<0.001)，并且全成分葡萄汁组的MDA含量也显著低于普通葡萄汁组(P<0.01)。

图7 给葡萄汁两组小鼠每天饮葡萄汁量

图11 小鼠跳台实验结果A潜伏期；B错误次数

图12 小鼠肝、肾和脑脏器指数变化A肝脏器指数；B肾脏器指数；C脑脏器指数

图13 小鼠肾脏器氧化酶及抗氧化酶检测A SOD；B GSH-Px；C MDA

2.10 小鼠肾脏HE染色病理切片

HE染色可见小鼠肾脏组织形态发生变化(图14)，模型组小鼠与正常组小鼠相比，肾小球肿胀，出现明显的体积增大和细胞增多，与周围组织间隙变小(图中箭头所指位置)。肾小管上皮细胞出现细胞水肿，也就是常说的颗粒变性或空泡变性，且肾小管上皮细胞有坏死脱落和水肿，乃至肾小管管腔消失。全成分组与普通组上述病变形态均有一定改善，且全成分组优于普通组的改善情况。

图14 小鼠肝脏HE染色病理切片

2.11 Western blot检测不同蛋白含量

Western blot法测各组小鼠脑组织中FOXO3a、Sirt1、Sirt6、p53和p21蛋白表达水平。从图14可以看出，模型组相对于正常对照组FOXO3a蛋白的表达显著升高(P<0.001)，全成分组与普通组的FOXO3a蛋白表达量与模型组相比均有所降低(图15A)。从图15B中可以看出，模型组相对于正常对照组Sirt1蛋白的表达量显著降低(P<0.01)，全成分组与普通组的Sirt1蛋白表达量与模型组相比均有所升高，其中，全成分组Sirt1蛋白表达量相对于模型组具有显著性差异(P<0.05)。模型组相对于正常对照组p53蛋白的表达量显著降低(P<0.01)，全成分组与普通组的Sirt1蛋白表达量与模型组相比均有所升高，其中，全成分组Sirt1蛋白表达量相对于模型组具有显著性差异(P<0.05)(图15B)。与正常对照组相比，模型组p53蛋白表达显著降低(P<0.001)，全成分组与普通组的Sirt6蛋白表达量与模型组相比均略有所升高，且全成分组的作用更好(图15C)。与正常对照组相比，模型组Sirt6蛋白表达有所降低，全成分组与普通组的Sirt6蛋白表达量与模型组相比均略有所升高，且全成分组的作用更好(图15D)。从图15E中可以看出，模型组相对于正常对照组p21蛋白的表达量有所增高，全成分组与普通组的p21蛋白表达量与模型组相比均有所降低。

3 讨论与结论

葡萄是一种营养价值高的食物，其中所含有的白藜芦醇等成分有着显著的抗氧化、抗衰老作用[4-9]，但上述成分多存在于葡萄皮及葡萄籽中[1-3]。由于其口感粗糙生涩难以下咽，且食用后也不易于被人体消化吸收，常常被丢弃，不仅造成极大浪费，也难以发挥葡萄在生活中应有的抗衰老作用。破壁处理后的葡萄，能更多释放出原本存在皮和籽中的上述抗衰老物质，更利于被人体消化吸收，发挥作用。本研究结果表明，全成分葡萄汁中更多的营养物质得以释放而应用，其中，白藜芦醇、山奈酚和槲皮素含量均显著高于普通葡萄汁。

在对衰老的预防和治疗研究中，鉴于小鼠基因和人类基因的相似性以及小鼠生命周期短暂，药物的抗衰老活性研究多通过建立小鼠衰老模型来检验药物的抗衰老效果。D-半乳糖注射法因其简便易行，现多用于抗衰老试验研究[1，10]。实验小鼠皮下注射150mg/kg D-gal后，小鼠自主活动次数明显减少；跳台潜伏期显著缩短、错误次数明显增加；肝脏指数明显增加，并引起的肾小球肿胀及肾小管上皮细胞水肿；抗氧化酶SOD的含量和GSH-Px水平显著降低，脂质过氧化物MDA含量明显升高；促衰老蛋白FOXO3a、p21的表达显著升高而抗衰老蛋白Sirt1、Sirt6的表达水平显著降低[11-13]。由此可见，应用D-gal皮下注射造成小鼠衰老模型，可以用来观察不同葡萄汁的抗衰老作用。

连续7w分别给予2组实验小鼠普通葡萄汁和全成分葡萄汁，均能够增加D-gal导致的小鼠自主活动次数的减少，延长跳台潜伏期、减少错误次数、提高小鼠学习记忆能力。饮用全成分葡萄汁能够显著改善D-gal导致的小鼠肝脏指数增加和肾小球肿胀及肾小管上皮细胞水肿的病理状态，提高抗氧化酶SOD、GSH-Px的含量，抑制脂质过氧化物MDA含量的升高，同时能够降低促衰老蛋白FOXO3a、p21的表达，促进抗衰老蛋白Sirt1、Sirt6的表达。在相同饮用量的情况下，全成分葡萄汁抗衰老效果要优于普通葡萄汁。

以上实验结果显示，全成分葡萄汁能够明显抵抗小鼠的衰老反应，其抗衰老效果优于普通葡萄汁。这为日常抗衰老提供了一种行之有效的食疗方法。◇

图15 Western blot检测不同蛋白含量A FOXO3a；B Sirt1；C p53；D Sirt1；E p21；F Western blot灰度图