银杏叶复方对LPS应激断奶仔猪小肠黏膜形态及上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量的影响

李 焰，兰天香，邱龙新*，林丽萍，戴爱玲，郭 豪

（1.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩 364000；2. 福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，福建龙岩 364000；3.福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室，福建龙岩 364000）

母猪早期断奶技术能最大限度提高母猪的生产力及其栏舍利用率，但由于仔猪断奶时自身免疫系统尚未完善，在日粮、环境等外界因素影响下易造成免疫应激。应激状态中动物体内合成代谢明显低于分解代谢，致使机体蛋白质合成不足，需要消耗大量能量来改善已失衡的内环境，此时受到生长抑制的断奶仔猪体内用于维持生长的营养物质将转向于维持与免疫相关的过程[1]，使得饲料利用率降低，严重影响养猪生产的经济效益，因此寻找出缓解断奶仔猪免疫应激的有效措施至关重要。现阶段，在饲料中添加化学合成药物和抗生素等饲料添加剂虽可以有效预防疾病、缓解免疫应激，促进动物生长，但因抗生素滥用而引发的细菌耐药性以及药物残留问题不容忽视。世界卫生组织在2017年11月7日建议农民和食品企业不应再对健康动物例行使用抗生素，国际上开始掀起对天然药物研究的热潮。课题组前期研究发现，银杏叶复方制剂通过调控细胞因子生成，正向调节由环磷酰胺（CY）介导的小鼠的细胞免疫，能有效拮抗CY对肝脾组织造成的损伤，并且效果优于经典方剂-四君子汤[2]，银杏叶对于脾虚性腹泻断奶仔猪肠道黏膜及肝脾组织的损伤有一定的修复和维持作用[3]，但是否能缓解由免疫应激造成的断奶仔猪生长抑制及其对免疫功能的影响需要进一步研究。因此，本试验中选用大肠杆菌脂多糖（LPS）刺激断奶仔猪以期建立免疫应激模型，探讨银杏叶复方制剂对断奶仔猪的小肠黏膜形态及其上皮内淋巴细胞（IEL）和杯状细胞（GC）数量的影响，旨在为探讨银杏叶复方是否对免疫应激断奶仔猪产生调控作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 银杏叶复方制剂的制备 银杏叶复方制剂由银杏叶、陈皮、砂仁、党参、黄芪、白术、茯苓等按一定比例组成。采用传统水煎法制备，蒸馏水预先浸泡2 h，达到第1次沸腾时保持微沸30 min，滤出药液；药渣加温水再次煮沸后，仍保持微沸30 min，滤出药液，合并2次药液，利用沸腾水浴将药液浓度浓缩成每毫升含1g生药（按照生药量计算），-20 保存备用。

1.2 试验药品 LPS：大肠杆菌血清型 O55:B5，Sigma公司。

1.3 断奶仔猪免疫应激模型的建立 试验选取平均体重为（9.52±0.80）kg（35±1）日龄的杜 × 长 × 大杂交断奶仔猪36头，按体重、胎次等处理原则随机分为3个处理，每个处理分为4个重复，每个重复3头。3个处理组均饲喂基础日粮，其中，银杏叶复方组每头每天灌服110 mL银杏叶复方制剂，LPS应激组每头每天灌服110 mL生理盐水，对照组每头每天灌服110 mL生理盐水，预试期7 d，正试期27 d。在正式试验第23天对LPS应激组和银杏叶复方组进行腹膜注射LPS，注射剂量为100 μg/kg，对照组腹膜注射等量的生理盐水。

1.4 样品的采集及指标测定 正试期结束后，对所有试验猪进行屠宰取样。从仔猪十二指肠、空肠及回肠中段切取约1cm2的组织样，用0.9%生理盐水冲洗净肠道内容物，放入10%的福尔马林中固定，制成切片观察。

1.4.1 各肠段黏膜形态的测定 在光镜下分别观察比较各试验组中3段小肠的肠黏膜形态结构，选取视野中6根较长且走向平直的肠绒毛运用Motic Images Plus 2.0照相处理软件测量其长度，选取各样本中最为完整的隐窝测量其深度，并计算肠绒毛高度/隐窝深度（V/C）。绒毛顶端至肠腺开口的垂直高度为肠绒毛高度，肠腺开口处至黏膜肌层的垂直高度为隐窝深度[4]。

1.4.2 各肠段上皮内淋巴细胞及杯状细胞数量的测定光镜下详细观察各肠段中肠绒毛的形态特点及其IEL和GC的总体分布情况。计数方法：每张切片观察5个视野，从中选择6根走向平直且排列整齐的肠绒毛，计数每100个小肠黏膜上皮细胞中含有的IEL及GC数量，IEL计数表示为每100个上皮细胞对应的IEL数量；以高碘酸－希夫（PAS）对GC进行染色，GC计数表示为每100个上皮细胞对应的GC数量[5]。

1.5 统计分析 数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，均值的多重比较采用Duncan's进行，结果以用均值±标准差表示，以P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果分析

2.1 银杏叶复方对LPS应激断奶仔猪肠道黏膜形态的影响 由表1可知，银杏叶复方组与对照组的十二指肠、空肠绒毛高度较LPS应激组显著提高（P＜0.05），银杏叶复方组回肠绒毛高度显著高于LPS应激组和对照组（P＜0.05）；银杏叶复方组十二指肠、空肠隐窝深度显著低于LPS应激组和对照组（P＜ 0.05）；与对照组及LPS应激组相比，银杏叶复方显著提高了其十二指肠、空肠及回肠段的V/C（P＜0.05）。各组肠黏膜形态光镜观察结果见图1，银杏叶复方组十二指肠绒毛排列有规则，且与其余2组相比其长度相对较长，LPS应激组肠绒毛上皮内细胞少数变性坏死脱落；LPS应激组空肠绒毛相对其余2组较为低矮，结构不清晰，肠绒毛末端上皮细胞脱落，对照组空肠绒毛紧密排列，与LPS应激组相比起肠绒毛结构较为完整，银杏叶复方组肠绒毛排列紧密且有规则且肠绒毛结构较为完整，隐窝较浅；银杏叶复方组回肠无绒毛脱落，排列整齐有规则且其绒毛长度高于对照组及LPS应激组，固有层、黏膜下层、肌层未见明显病理变化，LPS应激组绒毛末端存在少数上皮细胞变性脱落现象且绒毛周边不完整，排列稀疏，对照组回肠绒毛排列规则且结构较为完整。IEL多分布于上皮细胞基底膜附近，胞核深染，胞质少；LPS应激组空肠段肠绒毛固有层及腔面内中有少量游离的IEL；在LPS应激条件下，LPS应激组的小肠IEL数量明显减少，而银杏叶复方组的小肠IEL显著增多。GC散在于肠黏膜上皮层柱状细胞之间，呈散在的淡色空泡状；在免疫应激条件下，LPS应激组的小肠GC显著减少，银杏叶复方组肠上皮细胞呈单层整列且排列紧密，GC轮廓清晰。

表1 银杏叶复方对断奶仔猪小肠黏膜形态的影响（n=12）

图1 各组肠道光镜图（HE，×40）

图2 各组肠道细胞光镜图（×400）

2.2 银杏叶复方对LPS应激断奶仔猪小肠IEL及GC数量的影响 由表2可知，银杏叶复方组小肠各段IEL和GC数量均显著高于LPS应激组（P＜0.05），十二指肠、空肠的IEL数量与对照组差异不显著（P＞0.05），但回肠IEL数量较对照组显著提高（P＜0.05）；银杏叶复方组十二指肠、空肠的GC数量均显著高于对照组（P＜0.05），但回肠GC数量与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

由图2可看出，对照组的十二指肠肠绒毛表面为单层柱状上皮，在肠黏膜上皮细胞中，GC靠近细胞基底膜，呈高柱状，胞核为椭圆形，轮廓清晰，呈单层排列；

3 讨 论

3.1 断奶仔猪免疫应激模型的建立 LPS属于革兰氏阴性菌细胞壁中的最外层结构，在生理及病理条件下通过胃肠道进入机体内，可使机体产生应激反应，致使机体发热，出现采食量下降以及生产性能降低等现象。现代动物营养免疫学中常利用LPS建造断奶仔猪免疫应激模型[6]。本试验中，LPS诱导断奶仔猪产生了一系列细菌感染症状，表现为厌食、发热、呕吐腹泻，这与上述文献的结果一致，说明免疫应激模型建立成功。本试验旨在观察银杏叶复方对LPS应激断奶仔猪小肠黏膜形态的修复作用，故在LPS刺激后4 d采样[7]。

表2 银杏叶复方对断奶仔猪小肠上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量的影响（n=12）

3.2 银杏叶复方对免疫应激模型断奶仔猪肠黏膜形态的影响 小肠是动物体消化道中主要吸收营养物质的器官，断奶仔猪受到免疫应激引起小肠形态结构发生变化，如肠绒毛萎缩、隐窝深度增加、肠道功能的完整性受到破坏，致使其消化吸收功能发生改变[8]。本试验中以V/C衡量小肠消化吸收功能状态，若比值升高则表示动物体肠道黏膜及其消化吸收功能有所改善。同时，隐窝深度还反映其肠道上皮细胞的生成率[9]。李焰等[10]研究发现，在断奶肉兔的日粮中添加适量银杏叶复方能够对小肠黏膜组织起修复和维持作用。本试验中，银杏叶复方组显著提高了应激型断奶仔猪小肠段肠绒毛高度以及V/C，除此之外，LPS应激组的十二指肠以及空肠隐窝深度显著高于银杏叶复方组，表明银杏叶复方对受损肠道黏膜结构起一定的修复作用。

3.3 银杏叶复方对免疫应激模型断奶仔猪肠道内IEL与GC数量的影响 高玉云等[11]报道，肠道细胞的高速增殖、细胞凋亡、上皮细胞和淋巴细胞的更新与断奶仔猪肠道营养物质的利用率和新陈代谢直接相关。肠道黏膜上皮细胞通过模式识别分子（PRRS）识别病原及其分泌的毒素产生先天性免疫应答，是机体天然的机械屏障[12]，肠上皮细胞以紧密连接为主，GC分泌的黏液组成动物体与外界的一层屏障，是动物机体阻止病原菌入侵的第一道防线[13]。断奶仔猪受到免疫应激后，由于肠上皮细胞构成的天然屏障受到破坏，因此修复肠道上皮细胞成为至关重要的因素之一。石辛普[14]提出，肠上皮细胞的修复与更新离不开与其密切相关的IEL，动物体在受到抗原和病原微生物入侵时，小肠IEL是机体免疫系统中最先与其斗争的免疫细胞[15]；石玉祥等[16]研究表明，IEL数量不仅可以提示小肠免疫防御功能的完善程度以及局部黏膜免疫屏障的完整性，还能通过调控相关细胞因子的方式调节上皮细胞和其他淋巴细胞功能。GC通过分泌黏液而附着在小肠黏膜的表面，起保护肠黏膜作用，GC还能阻止上皮细胞与毒素直接接触，通过黏膜表面分泌黏液在机体局部执行特异性或者非特异性免疫功能[17]。小肠的肠黏膜形态和小肠上皮细胞特定结构共同作用形成机体抗感染的重要防线。课题组前期研究发现，银杏叶复方组脾虚性断奶仔猪十二指肠杯状细胞数、空肠和回肠上皮内淋巴细胞数目显著高于模型组[3]。本试验中，LPS应激组中的小肠IEL以及GC数量较对照组及银杏叶复方组显著减少，表明银杏叶复方可修复免疫应激型断奶仔猪受损的肠道黏膜屏障。

4 结 论

综上所述，银杏叶复方可缓解LPS造成的免疫应激，且能维持并修复断奶仔猪肠黏膜形态，从而改善机体肠道的消化吸收功能，提高生产性能。