焦磷酸溴代醇诱导γ9δ2T淋巴细胞产生的实验研究

夏 莉，于 鸿，魏天雪，魏本杰，迟艳飞，丁 旭，刘玉侠*

(1.吉林省人民医院，吉林 长春130021;2.吉林省肿瘤防治研究所，吉林 长春130012;3.吉林省银丰生物工程技术有限公司，吉林 长春130000)

众所周知，T淋巴细胞在人体的抗肿瘤、抗感染等方面发挥着重要作用。而在抗肿瘤等方面的作用中，γδT细胞又起着关键作用。γδT细胞是T细胞的一个亚群，约占外周血T细胞的1-10%[1]，由于其在体内含量较低，难以发挥功效，近年来对其体外培养扩增方法的研究较多。研究发现，γδT细胞中有一组细胞群—γ9δ2T细胞对γδT细胞功能的发挥起着至关重要的作用。因此，本实验从体外诱导方法入手，用焦磷酸溴代醇(BrHPP)、抗γδTCR等探讨不同方法组合对γ9δ2T细胞产生的影响，为γ9δ2T细胞的产生和扩增提供新的方法，也为γ9δ2T细胞的应用提供有效的细胞。

1 材料与方法

1.1材料焦磷酸溴代醇(BrHPP)：法国Inserm研究所的Mary Poupot博士馈赠； anti-γδTCR：Biolegend；IL-2：北京四环生物制品公司；RPMI1640：Gibco公司；胎牛血清：天津TBD公司；FITC-Vγ9TCR：BD pharmingen(Catalog No.555732)；PE-Vδ2TCR：BD pharmingen(Catalog No.555739)；FITC-CD3：Biolegend( Catalog 300406)；淋巴细胞分离液、高效PBMC离心管：天津灏洋华科生物科技有限公司；流式细胞仪：BD公司。

1.2方法

1.2.1分离外周血单核细胞 按照高效PBMC离心管提供的方法进行分离。简述如下：抽取健康志愿者外周血，用PBS等倍稀释后，加入到高效PBMC离心管，2 500 rpm,离心20 min,取白细胞层，再离心洗涤后，计数，加到细胞培养瓶培养，每瓶10 ml，2 h后进行诱导。

1.2.2以上分离培养的细胞按以下设计加入不同的试剂和细胞因子进行诱导。

第1瓶：IL-2，1000 U/ml

第2瓶：IL-2，1000 U/ml+TCR0.8 μg/ml

第3瓶：IL-2，1000U/ml+BrHPP3 μmol/L

培养3天后，视细胞生长状况，每瓶补加IL-2后分瓶继续培养，培养第10天用流式细胞仪检测三种方法培养细胞γ9δ2TCR的表达。

2 结果

2.1IL-2培养10天细胞γ9δ2TCR表达检测结果，见图1、图2、图3。

图1图2图3

图1-3IL-2培养10天细胞γ9δ2TCR表达检测结果

从图1、图2、图3中可以看出，IL-2培养的细胞的γ9 TCR、δ2TCR、γ9δ2TCR的表达极低,几乎没有表达。

2.2anti-γδTCR联合IL-2培养10天细胞γ9δ2TCR表达检测结果，见图4、图5、图6。

图4图5图6

图4-6anti-γδTCR联合IL-2培养10天细胞γ9δ2TCR表达检测结果

从图4、图5、图6可以看出，anti-γδTCR联合IL-2培养的细胞γ9TCR表达较高，为98.1%，δ2TCR表达较低，为10.6%，而γ9δ2TCR共同表达较低，为10.7%。

2.3BrHPP联合IL-2培养10天细胞γ9δ2TCR表达检测结果，见图7、图8、图9。

图7图8图9

图7-9BrHPP联合IL-2培养10天细胞γ9δ2TCR表达检测结果

从图7、图8、图9可以看出，BrHPP联合IL-2培养的细胞γ9TCR和δ2TCR表达都较高，分别为65.1%和64.1%，γ9δ2TCR共同表达也较高，为61.6%。

3 讨论

T细胞根据表面抗原受体(T cell receptor,TCR)的不同表达可分为αβT细胞和γδT细胞。γδT细胞是近年来逐渐认识的一种T细胞亚群，γδ分子结构中的γ链、δ链和CD3分子共同构成γδT细胞的抗原识别受体。γδT细胞多为CD4-、CD8-细胞。它与CD3分子以共价键方式相连，构成CD3-TCRγδ复合体，并通过抗原提供活化信号。目前发现，γδT细胞在机体抗肿瘤免疫和抗感染中发挥重要作用[2-4]。

γδT细胞是体内固有免疫中的一个重要T细胞亚群，广泛分布于消化系统和呼吸系统上皮组织内，末梢血中也有一定数量的γδT细胞。随着对γδT细胞结构和功能研究的不断深入，发现γδT细胞对抗原的识别无主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)限制性，无需抗原细胞递呈。具有选择性靶向杀伤肿瘤细胞的作用，成为目前国内外研究免疫细胞过继疗法治疗肿瘤的热点。

γ9δ2T细胞即Vγ9Vδ2T细胞，存在T细胞外周血中，是一种固有的具有免疫效应的淋巴细胞[5]是γδT细胞的主要细胞群，80%以上的γδT细胞为Vγ9Vδ2T细胞[6]，且更有利于识别通过下调人类肿瘤抗原、白细胞抗原进行免疫逃逸的肿瘤细胞[7]。在γδT细胞抗肿瘤、抗感染免疫中发挥重要作用。虽然γδT细胞具有重要的生物学功能，但是由于它在体内含量较低[8]，影响其发挥作用。目前对于它的体外扩增方法很多，如用anti-γδTCR联合IL-2[9]，唑来膦酸及其它膦酸化合物联合IL-2等方法[10，11]。本实验选用焦磷酸溴代醇(BrHPP)联合白细胞介素2(IL-2)作为体外诱导γδT细胞的组合，并与anti-γδTCR联合IL-2及单独IL-2等方法诱导的细胞进行比较。结果证明，焦磷酸溴代醇(BrHPP)联合白细胞介素2(IL-2)诱导的细胞高表达γ9TCR、δ2TCR和γ9δ2TCR，分别为65.1%、64.1%和61.6%；anti-γδTCR联合IL-2培养的细胞γ9TCR表达较高，为98.1%，δ2TCR和γ9δ2TCR表达较低，分别为10.6%和10.7%；而IL-2培养的细胞γ9 TCR、δ2TCR、γ9δ2TCR的表达极低,几乎没有表达。

从我们的实验结果可以看出，焦磷酸溴代醇(BrHPP)联合白细胞介素2(IL-2)诱导的细胞无论是单独的γ9TCR、δ2TCR还是γ9δ2TCR都有较高表达；而antiγδTCR联合IL-2培养的细胞γ9TCR表达较高，δ2TCR和γ9δ2TCR表达很低；IL-2培养的细胞γ9 TCR、δ2TCR、γ9δ2TCR的表达极低,几乎没有表达。

此实验证明，焦磷酸溴代醇(BrHPP)联合白细胞介素2(IL-2)可以诱导γ9δ2T 细胞的高表达，为γδT 细胞的应用提供了有效的细胞数量，也为其进一步研究打下了基础。