应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析饲粮添加丁酸钠对蛋雏鸡盲肠微生物的影响

张李荣， 杨海明

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009）

动物肠道寄居着大量微生物，包括细菌（最多）、古菌、真菌、原虫和病毒。肠道微生物区系的形成受个体、年龄、健康状况和环境等多种因素的影响（刘彩虹，2013）。微生物对宿主肠道结构功能、物质消化吸收、肠道免疫调节等具有重要影响（Stanley，2014）。 吴娟娟等（2015）研究发现，盲肠内容物对无菌鸡小肠黏膜、绒毛及脾脏发育等均有显著影响，同时可调控脂肪代谢相关基因的表达。周作勇等（2011）研究报道，鸡肠道微生物表面分子结构 （PAMPs）可与模式识别受体PRRs（如Toll样受体）相互作用，激活相关免疫信号路径。鸡盲肠每克粪便大约含有1011个微生物，同时与其他肠道相比，盲肠微生物的种类多且复杂，菌种含量更高，所以盲肠成为了研究焦点（王丽凤，2013）。目前，微生物研究技术越来越成熟和多样化，特别是二代测序技术的出现及运用以来，准确而全面地了解微生物成为可能（Ansorge，2009）。

丁酸钠是一种新型饲料添加剂，具有促进动物生长、维护肠道健康、平衡肠道菌群和为机体后肠细胞提供能量等一系列功能 （陈小兵等，2007）。郭传珍等（2009）研究表明，饲粮中添加丁酸钠后，可降低肉鸡消化道各段pH及提高肠道后段短链脂肪酸浓度，同时丁酸钠对肠道菌群具有明显的平衡作用。邹杨等（2010）研究表明，丁酸钠能够提高肉仔鸡的饲料转化率，改善生产性能，降低肠道pH，且能够提高肠道挥发性脂肪酸的含量。因此，本试验选用Illumina MiSeq高通量测序技术，分析饲粮中添加丁酸钠对蛋雏鸡盲肠微生物的影响，通过微生物丰度和多样性比较，了解样本间微生物组成差异，以期能更好地指导生产。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理 罗曼褐蛋公雏由金湖县永祥种鸡有限公司提供。丁酸钠购自上海麦克林生化科技有限公司。试验在扬州大学实验动物房进行，饲粮参照NRC（1994）营养需要配制，饲粮组成及营养水平见表1。按常规饲养和免疫程序进行饲养管理，自由采食和饮水。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.2 试验设计 选取1日龄健康、体重相近的罗曼褐蛋公雏120只，随机分成2个处理组，每组6个重复，每个重复10只鸡。对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂添加0.1%丁酸钠饲粮，试验期42 d。于42 d时，每个重复分别随机取6只鸡，测定其生长性能，再从中选出体重相近且状态良好的3只作为测序样本，收集盲肠食糜，应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析盲肠微生物。

1.3 样品采集 选取的鸡只处死，在无菌条件下打开腹腔，结扎盲肠两端，剪下后转移至超净工作台，用无菌剪刀剪开盲肠肠壁，采集食糜置于冻存管中，迅速投入液氮后转至-70℃保存，备用。后将样品送往上海生工生物工程股份有限公司进行16SrDNA高通量测序。

1.4 DNA提取和扩增 食糜样品采用OMEGA公司的E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒提取样品的总基因组DNA，具体步骤参照说明书，并用琼脂糖凝胶电泳进行定性检测和测定浓度。以提取的DNA为模板，对16SrDNA V3-V4可变区进行PCR扩增，融合了Miseq测序平台的通用引物序列：341F（CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG）和 805R（G ACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGAC TACHVGGGTATCTAATCC）。 扩增体系 30 μL：2×Taq master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F（10 μM）1 μL，Primer R （10 μM）1 μL，模板 DNA 20 ng。扩增条件：94 ℃ 3 min，5 个循环（94 ℃ 30 s，45 ℃20 s，65 ℃ 30 s），20 个循环 （94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72℃ 30 s），72℃延伸5 min。 PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Agencourt AMPure XP试剂盒对扩增产物进行纯化并回收，利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量。采用标准Illumina TruSeq DNA文库制备流程构建所需的宏基因组上机文库，测序系统为Illumina MiSeq平台，最终上机测序浓度为20 pmol。1.5 数据处理与分析 用CASAVA对原始图像数据文件进行碱基识别（Base Calling）分析转化为原始测序序列（Raw Data）。再通过去杂拼接、质量控制、筛选并去除嵌合体序列步骤后，使用Usearch软件将干净序列按97%相似水平聚类成操作分类单元。计算丰度指数和多样性指数，并进行热图和主成分分析，利用R软件作图。将数据导入SPSS19.0，进行方差分析（ANOVA），以P＜0.05为显著性差异。

2 结果和分析

2.1 丁酸钠对雏鸡生长性能的影响 由表2可知，饲粮中添加丁酸钠对蛋雏鸡的体重、平均日增重（ADG）、料肉比均无显著影响（P ＞ 0.05），但丁酸钠组各指标均优于对照组。与对照组相比，丁酸钠组平均日采食量（ADFI）显著降低 1.52%（P ＜ 0.05）。

表2 丁酸钠对雏鸡生长性能的影响

2.2 盲肠食糜测序结果 由表3可知，对两组盲肠食糜样品进行测序，分别获得52153和60027条平均原始序列，在97%相似水平上分别平均归类成997和1008个操作分类单元。构建稀释性曲线，由图1可知，随着测序深度的增加，曲线趋于平坦，说明测序数据具有合理性，各样本能够真实反映微生物组成情况。

表3 盲肠食糜测序结果

图1 稀释曲线

2.3 门水平分析 由表4可知，两组雏鸡盲肠菌群主要存在厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门，合计分别占99.39%、97.98%。两组间变形菌门含量差异极显著（P ＜ 0.01），Synergistetes（互养菌门）含量差异显著 （P＜0.05）。变形菌门含量较对照组降低44.8%。同时，两组存在一定量放线菌门和极少量的疣微菌门。

表4 盲肠菌群门水平分布

2.4 属水平分析 由表5可知，在属水平上，两组主要存在拟杆菌属、Faecalibacterium、瘤胃球菌属、梭菌XⅣa类群、梭菌Ⅳ类群、Barnesiella等菌属。其中，拟杆菌属、梭菌XⅣa类群、Dorea、梭菌XⅧa类群等菌属的含量存在显著差异。同时，与对照组相比，丁酸钠组乳酸杆菌属显著提高38.6%（P＜0.05）。埃希氏菌属/志贺氏菌属含量极显著降低71.4%（P＜0.01）。未归类菌属含量差异极显著（P ＜ 0.01）。

表5 盲肠菌群属水平分布

2.5 Alpha多样性分析 本文选用 Chao1、Ace、Shannon、Simpson指数和覆盖率来评估样本中微生物Alpha多样性。Ace和Chao1指数用来估计物种丰度；Shannon和Simpson指数用来估计微生物多样性，多衡量群落异质性，两者值越大，则说明群落多样性越高。Coverage指数表示各样品文库的覆盖率，实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。

由表6可知，两组覆盖率均为0.99，接近于1，说明两组数据结果能反映真实菌群情况。从Chao1和Ace指数上看，丁酸钠组菌群丰度大于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。同时，与对照组相比，丁酸钠组Shannon和Simpson指数均显著大于对照组（P＜0.05）。综上说明，饲粮中添加丁酸钠后，雏鸡盲肠微生物不仅丰度增加，而且菌群多样性也显著提高，微生物种类更多，均匀性更高。

表6 盲肠微生物Alpha多样性分析

2.6 Heatmap图和PCA分析 Heatmap图 （图2-A）显示了不同处理组盲肠菌群属水平物种丰度，颜色从红到蓝，代表菌种丰度由低到高。由聚类树可知，各组样本具有较好的相似性。同时，对不同样本进行了主成分分析（PCA），由 PCA（图2-B）分析可知，第一主成分方差贡献率为45.57%，第二主成分方差贡献率为38.61%，累计为84.18%。对照组和丁酸钠组的样本点分布区域不同，说明处理间群落构成存在差异性。

图 2 盲肠微生物Heatmap分析图（A）和主成分分析PCA图（B）

3 讨论

研究表明，厚壁菌门、拟杆菌门和变形杆菌门是鸡和火鸡胃肠道最大的细菌门类，超过总数的 90%（Wei，2013）。 林奕岑等（2016）通过高通量测序技术分析肉鸡盲肠微生物多样性，发现前三位共享菌门分别为拟杆菌门（70.0%）、厚壁菌门（25.4%）、变形菌门（4.3%）。本研究显示，两组雏鸡盲肠菌群主要存在厚壁菌门、拟杆菌门及变形菌门3种，这与前人研究的结果类似。目前有学者认为，厚壁菌门和拟杆菌门两者含量的比例能够影响机体对能量的吸收。Turnbaugh等（2006）在小鼠上的研究发现，肥胖小鼠肠道富集厚壁菌门细菌，而拥有更高比例的拟杆菌门细菌小鼠相对瘦削。这可能是因为厚壁菌门细菌富含淀粉、半乳糖及丁酸等代谢酶，有助于促进机体对能量的吸收，更利于脂肪的沉积（Murphy，2010）。本试验中，丁酸钠对雏鸡生长性能改善效果明显，但厚壁菌门和拟杆菌门的含量未显示有显著变化（P＞0.05），推测可能是由试验动物、添加量、剂型及试验误差等因素造成的。变形菌门是细菌域中最大的一门，其中包括很多病原菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌等。本试验中变形菌门含量显著降低（P＜0.05），说明丁酸钠具有很好的平衡肠道菌群的作用。另外，组间互养菌门含量差异显著（P＜0.05）。互养菌门是一种较新分类门，属革兰氏阴性厌氧杆菌，具有降解氨基酸和丙酮酸的能力。Li等（2017）研究发现，互养菌门可能对鹅的盲肠具有重要影响，这有待进一步研究。

本试验结果显示，在属水平上，丁酸钠组拟杆菌属、Faecalibacterium、梭菌 XⅣa类群、梭菌Ⅳ类群、梭菌XⅧa类群等菌属含量均有一定程度提高。这与孙喆等（2017）研究结果类似，其在探讨酵母发酵培养物对内仔鸡盲肠菌群的影响时，发现盲肠内容物中以拟杆菌属、Faecalibacterium、乳酸杆菌属为主。梭菌是广泛存在肠道的共生菌，属于组成厚壁菌门的核心菌类，由多种复杂的异质菌种构成，分类的主要特征是革兰氏阳性、杆状及能形成芽孢（Collins，1994）。梭菌具有很强的发酵能力，产生的丁酸可优先被结肠上皮细胞吸收利用，为机体提供能量，促进肠上皮细胞生长，加速肠黏膜的修复，调控肠上皮细胞的基因表达。Mu等（2017）研究发现，纤维饲料可显著提高猪结肠梭菌XⅧa类群丰度和丁酰辅酶A的含量。同时，Ivanov等（2009）研究发现，梭菌XⅣa类群、梭菌Ⅳ类群、梭菌XⅧ能够诱导辅助性T细胞17（Th17）增殖分化，Th17能够分泌IL17、IL22等免疫因子，在机体免疫调节中起重要的作用。其含量变化可能指示机体的健康状况，Frank 等（2007）研究报道，炎症性肠病（IBD）患者肠道梭菌XⅣa类群含量显著低于健康受试者。Russell等（2012）研究发现，万古霉素治疗的小鼠肠道梭菌XⅣa、梭菌Ⅳ含量减少，从而加重小鼠过敏性哮喘。值得注意的是，有报道显示梭菌类群能够机会性感染宿主，但这可能是部分或单个菌种在宿主免疫功能降低时造成的，而并不具有强致病感染能力（Nava，2011）。以上结果说明，饲粮中添加丁酸钠有助于雏鸡盲肠发酵菌的增殖，使机体拥有更强的发酵能力。另外，本试验结果显示，添加丁酸钠可显著提高有益菌乳酸杆菌属含量（P＜0.05），而极显著降低有害菌埃希氏菌属/志贺氏菌属的含量（P＜0.01）。乳杆菌属具有促进肠道屏障发育、调节肠道免疫功能、降低腹泻风险等功能。志贺氏菌属根据抗原可分为四类，可引起细菌性痢疾，而管家基因的测序表明，志贺氏菌属应该和肠侵袭性E.coli（EIEC）归为一类，两者都能以相同方式入侵肠道，从而引起疾病（Beld，2012）。说明丁酸钠能够促进有益菌增殖而抑制有害菌繁殖。

研究发现，机体在疾病或应激状态下，肠道菌群种类和数量都会下降（李永洙，2015）。而本试验通过Alpha多样性分析，发现丁酸钠能够提高雏鸡盲肠微生物丰度，显著提高微生物多样性（P＜0.05）。这也与Heatmap和PCA分析结果相验证，即两组微生物存在差异性。说明通过添加丁酸钠可重新平衡肠道菌群，以提高雏鸡盲肠菌群种类和改善微生物均匀性，使雏鸡对抗不良因素的能力增强。

4 小结

饲粮中添加丁酸钠有利于促进雏鸡生长，且能平衡肠道菌群，提高菌群丰度和多样性，使微生物种类更多，均匀性更好。