衰老对大鼠结肠干细胞增殖分化功能及微环境的影响

程志豪 顿耀艳 刘 洁 李玉婷 郭煜晖 何毓敏 袁 丁 张长城

(三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002)

Effectsofagingoncolonstemcellsandmicroenvironmentinrat

CHENGZhi-Hao,DUNYao-Yan,LIUJie,etal.

MedicalCollegeofThreeGorgesUniversity,Yichang443002,Hubei,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes of rat colon stem cells and their microenvironment of Wnt/β-catenin signaling pathway during the aging process.MethodsMale SD rats at different developmental stages were divided into adult group(6 months)and aging group(24 months), 10 rats in each group.Routine periodate and Schiff reagent (PAS) staining, alcianblue staining, immunohistochemistry and RT-PCR were used to detect changes in adult group and aging group colon stem cell proliferation and differentiation and Wnt/β-catenin signaling pathway.ResultsCompared with those of adult group, the number of goblet cells in aging group were decreased(P<0.01), mRNA expressions of stem cell markers Lgr5, Bmi-1, MUC1,MUC2 were reduced(P<0.01), the expression of PCNA was increased(P<0.01), the microenvironment Wnt/β-catenin signaling pathway related proteinβ-catenin expression was increased(P<0.05), the expression of GSK-3β was decreased(P<0.01).ConclusionsDuring the rat aging process, the number of colon stem cells and the globet cell differentiation of intestinal stem cells are reduced, the proliferation of colon stem cells are increased , Wnt/β-catenin signal pathway is up-regulated.

【Keywords】 Aging; Colon stem cells; Wnt/β-catenin signal pathway

研究显示，机体的衰老始于肠道衰老〔1〕。肠道主要功能是吸收营养物质及作为一个屏障阻挡细菌、病毒等有害物质进入机体。衰老过程中，肠道免疫系统受到损害、炎症反应也增加，老年人经常出现慢性便秘、排便障碍和尿失禁等症状及对肠道感染的易感性增加〔2〕。肠黏膜在机体中更新频率最高，而肠黏膜不断更新依赖于肠道干细胞的增殖、分化。结肠上皮的单层柱状上皮内陷并被固有层包围形成隐窝，每个隐窝由其中的肠干细胞维持〔3〕。结肠组织中存在多种类型的干细胞，在维持结肠正常生理功能和促进黏膜炎症伤口愈合中有重要作用〔4〕。

肠道干细胞主要分为两种：Lgr5(G-protein-coupled receptor-5)标记的窝基底柱状细胞(CBC)为活化的干细胞；而另一种Bmi-1(Bmilpolycombringfinger oncogene 1)特异性标记的DNA 标记滞留细胞(LRC)处于静止状态〔5，6〕。大量研究表明，肠道干细胞受其所处的微环境中Wnt/β-catenin通路调控〔7〕。有研究表明，衰老伴随干细胞增殖分化功能的改变及干细胞的衰退〔8〕。本课题组前期研究显示，衰老大鼠小肠干细胞数量减少，干细胞微环境Wnt/β-catenin信号下调〔9〕。但衰老过程中大鼠结肠干细胞的增殖分化功能及其微环境是否发生变化尚不明确。本研究旨在探讨衰老过程中大鼠结肠干细胞增殖分化功能及其微环境中Wnt/β-catenin信号通路的变化。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级6月龄、24月龄雄性SD大鼠各10只，购自三峡大学医学院实验动物中心，生产许可证号：SCXK(鄂) 2011-0061。

1.2主要试剂 RNA逆转录试剂盒，日本TaKaRa公司；Lgr5、Bmi-1、MUC1、MUC2、β-actin 引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：Lgr5上游(5′→3′)CCTGGGAAAGCAAACCCG，下游(5′→3′)CGGAATCGGAAGGCAAGTC；Bmi-1上游(5′→3′)ACTCTGGGAGCGACAAGGC，下游(5′→3′)GATGATTTCCGAGGTCTACTGGC；MUC1上游(5′→3′)CACTCACGGACGCTATGTGC，下游(5′→3′)GGTTGGTGTAAGAGAGACCGCTAC；MUC2上游(5′→3′)CACGACACCAGGACCTTTCC，下游(5′→3′)TGCTTGGGAGGCACGAAG；β-actin上游(5′→3′)TGACCGAGCGTGGCTACAG，下游(5′→3′)CAGGGAGGAAGAGGATGCG。一抗β-catenin、GSK-3β，美国 Santa Cruz公司。

1.3主要仪器 摊片烤片机(CS-V1)，宏业医用(湖北孝感)仪器有限公司；超薄切片机(ULTR ACUTR)，Leica 公司(德国)；光学倒置显微镜(CX41)，日本Olympus公司；1-15K离心机，德国 Sigma公司；JB-3恒温磁力搅拌器，常州澳华司乐仪器(AHYQ)有限公司。

1.4方法

1.4.1动物分组及样品处理 大鼠分为成年组(6月龄大鼠)、老年组(24月龄大鼠)各10只。自由饮水，禁食24 h。麻醉后取血打开腹腔，取近端结肠段1～2 cm，放入包埋盒并立即投入4%多聚甲醛中，4℃固定24 h后更换75%酒精，常规脱水，石蜡包埋。

1.4.2HE染色、高碘酸-雪夫试剂(PAS)染色和阿利新蓝染色 石蜡连续切片，每张厚4 μm，每隔5张取1张，依次在冷水、热水中摊开后黏附于载玻片上，60℃烤4 h。切片机连续切片(4 μm)，经过冷水、45℃热水摊片后黏附于载玻片上，60℃烤4 h。阿利新蓝染色：常规脱蜡后，先蒸馏水冲洗，然后甩干液体立即滴加阿利新蓝染液，孵育5 min，蒸馏水冲洗干净，甩干后每个组织上滴加一滴核固红染液室温孵育2 min，流水冲洗后吹干封片。PAS染色：常规脱蜡后，用蒸馏水冲洗，甩干每张玻片上的蒸馏水，滴加高碘酸染液孵育10 min，流水冲洗后，甩干组织上的水分，滴加一滴雪夫试剂避光孵育10 min，流水冲洗，滴加苏木素染液1 min，流水冲洗，吹干封片。显微镜取图，每组随机取5只大鼠，每只大鼠结肠各取3张不连续切片。阿利新蓝、PAS染色计数不同组别每只大鼠10个隐窝杯状细胞的数量，取平均值。

1.4.3免疫组织化学染色 结肠组织石蜡切片每张厚4 μm，黏附于防脱载玻片上，60℃烤4 h。常规脱蜡后，用蒸馏水浸泡3 min，配制柠檬酸盐修复液高压修复6 min，修复完后自然冷却至室温。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次5 min，甩干后滴加3%过氧化氢(H2O2)37℃孵育10 min，PBS冲洗3次，每次5 min，甩干水分后每个组织滴加一滴5%半血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h，PBS冲洗干净后，加一抗湿盒中4℃孵育过夜，PBS冲洗；二抗室温孵育1 h，PBS冲洗，甩干后临时用蒸馏水配制二氨基联苯胺(DAB)显色，显色完成后流水冲洗，甩干后滴加苏木素40 s，盐酸酒精分化1 s，流水冲洗后脱水，风干封片。取图后分析并计算增殖细胞核抗原(PCNA)、β-catenin、GSK-3β表达。

1.4.4RT-PCR 称取适量新鲜结肠组织，提取组织中的总RNA，并用焦磷酸二乙酯(DEPC)水溶解，核酸测定仪测定RNA浓度，计算D(λ)260/D(λ)280比值，重复测定2次，两次测得的结果均在1.8～2.2，且两次测得浓度相差不得超过20 μg/ml。逆转录，扩增。扩增反应体系总体积为25 μl：10.5 μl DEPC水，12.5 μl PCR Master mix (2倍)，Lgr5、Bmi-1、MUC1、MUC2引物上、下游各0.5 μl，然后加入cDNA模板1 μl。β-actin作为内参。扩增条件：94℃5 min，94℃、30 s，55℃、30 s，72℃30 s，GOTO2，35个循环，72℃、5 min，4℃低温保存。配制2%琼脂糖凝胶，将扩增得到的产物加入到配制好的凝胶孔中进行电泳30 min，凝胶成像仪拍照保存内参和目的条带，运用Image J软件计算Lgr5、Bmi-1、MUC1、MUC2与β-actin光密度比值。

1.5统计学处理 采用SPSS18.0软件行独立样本t检验。

2 结 果

2.1衰老对大鼠结肠组织干细胞标记物Lgr5、Bmi-1 mRNA的影响 与成年组比较，老年组Lgr5、Bmi-1 mRNA表达量显著降低(P<0.01)。见图1，表1。

图1 两组结肠组织Lgr5、Bmi-1 mRNA表达比较

组别Lgr5Bmi-1MUC1MUC2成年组0.91±0.141.10±0.161.50±0.191.48±0.18老年组0.36±0.121)0.48±0.141)0.72±0.171)0.82±0.111)

与成年组比较:1)P<0.01

2.2衰老对大鼠结肠杯状细胞数量及分泌功能的影响 杯状细胞可以分泌被PAS染成红色的中性黏蛋白和被阿利新蓝染成蓝色的酸性黏蛋白。结果如表1，图2，表2所示，在结肠组织中与成年组比较，老年组结肠组织杯状细胞数量及MUC1、MUC2 mRNA表达显著降低(P<0.01)。

图2 各组结肠组织杯状细胞数量(×200)及MUC1、MUC2 mRNA的变化

组别阿利新蓝染色PAS染色成年组21.83±2.0218.33±0.57老年组14.33±1.891)12.67±1.041)

与成年组比较：1)P<0.01

2.3衰老对大鼠结肠组织PCNA蛋白表达的影响 与成年组比较，老年组大鼠结肠隐窝PCNA蛋白表达量显著增高(P<0.01)。见图3，表3。

2.4衰老对大鼠结肠组织β-catenin、GSK-3β蛋白表达的影响 免疫组化染色结果如表3，图4所示，与成年组比较，老年组大鼠结肠组织β-catenin蛋白表达增加，GSK-3β蛋白表达量显著降低(P<0.05或P<0.01)。

图3 两组结肠组织PCNA表达(×200)

组别PCNAβ-cateninGSK-3β成年组0.09±0.010.59±0.050.76±0.05老年组0.29±0.042)0.73±0.021)0.39±0.062)

与成年组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

图4 各组大鼠结肠组织β-catenin、GSK-3β的表达(×200)

3 讨 论

肠道干细胞位于隐窝的基底部，是肠道黏膜上皮正常再生及维持肠屏障功能的重要基础。Barker等〔10〕研究发现，在结肠隐窝底部中表达Lgr5的细胞能够分化成为黏膜中所有细胞类型。在小肠干细胞中，Lgr5特异性标记的CBC主要用于组织更新，Bmi-1特异性标记的LRC作为储备亚群，在组织损伤等情况下被激活。虽然有研究显示果蝇衰老时肠道干细胞的数量增多、分化成熟的细胞数量减少〔11〕，但在衰老过程中也有许多组织出现干细胞数量减少。PCNA可以反映细胞的增殖能力。前期研究表明，自然衰老大鼠中，小肠组织中Lgr5、Bmi-1、PCNA表达随年龄的增加有下调的趋势〔8〕。本研究结果显示，自然衰老过程中，大鼠结肠组织中Lgr5、Bmi-1 mRNA表达降低，而PCNA表达增高，表明衰老过程中大鼠结肠干细胞数量减少，结肠干细胞增殖能力增强。

肠道黏膜的黏液屏障功能的重要生理功能是抵御肠道细菌、病毒等有害物质，因此保持结肠黏膜完整性至关重要，而干细胞是结肠黏膜再生的基础。位于结肠隐窝底部的多能干细胞可以分化为肠细胞、杯状细胞和内分泌细胞这些最终分化的细胞〔4〕。肠道黏液屏障重要成分是肠道杯状细胞分泌的黏蛋白(MUC)，其中MUC1、MUC2是杯状细胞分泌的黏蛋白，对维持肠道稳态有重要作用。有研究表明老年小鼠肠道杯状细胞数量减少，MUC1、MUC2表达降低〔12〕。杯状细胞的数量及分泌功能可以反映结肠干细胞的分化功能。本研究结果显示，衰老大鼠杯状细胞数量明显减少，MUC1和MUC2表达明显降低，表明衰老过程中大鼠结肠干细胞向杯状细胞分化能力减弱。

肠道干细胞所处的微环境对其功能有重要影响，如Wnt/β-catenin 信号通路〔13〕。Wnt信号通路主要是胞膜外的Wnt蛋白结合卷曲蛋白和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5/6组成受体复合物，导致β-catenin聚集，并转位进入细胞核，导致一系列干细胞相关的基因转录。有研究表明，如将Wnt/β-catenin信号通路的腺瘤性结肠息肉病(APC)基因失活或β-catenin过度活化，小肠增殖将会出现失控〔14〕。本研究发现，衰老过程中，大鼠结肠组织β-catenin表达增多、GSK-3β的表达减少，表明衰老过程中大鼠结肠组织的Wnt/β-catenin 信号通路上调。

本研究显示，衰老过程中结肠干细胞数量减少、增殖能力增强、分化能力减弱，其微环境Wnt/β-catenin信号通路活化。肠道干细胞是肠道黏膜更新和维持肠屏障功能的重要基础，衰老过程中，大鼠结肠干细胞数量、增殖分化功能及其微环境的改变可能是衰老过程中一些肠道相关疾病发生的重要基础，本研究对于进一步探讨衰老过程中结肠干细胞衰退的机制、改善衰老相关肠道疾病提供了一种新的思路。