聚类分析法研究不同产地花生壳高效液相色谱指纹图谱

赵 亮，陈 月，方应国，饶桂维

(浙江树人大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015)

我国的花生年产量约为1 450万t以上，产生的花生壳约450万t，其中大部分被当成废渣丢弃或燃料使用，利用率极低[1]。花生壳约占花生质量的30%，其中主要含半纤维和粗纤维，两者约占花生壳质量的75%～80%，另有粗蛋白、粗脂肪、糖类与矿物质等成分[2]。此外，花生壳还含有一些功能成分，如黄酮类化合物、白藜芦醇、胡萝卜素、木糖、皂草甘等[3]。花生壳作为一种价廉、可再生的资源，是提取食物天然抗氧化剂和防腐剂的理想材料，具有广阔的应用前景[4]。

近年来，为提高花生壳的利用价值，科研人员对花生壳进行了大量的研究，如用于农用肥料、饲料、食品、复合材料、活性炭等多个领域[5]。薛伟等[6]以花生壳为原料制备一种无定形碳材料碳基固体酸，具有成本低、原料可再生和环境友好等优点。张再利等[7]以花生壳为生物吸附剂，研究其吸附Pb2+、Cu2+、Cr3+、Cd2+、Ni2+的动力学和热力学，结果表明，花生壳对5种金属离子的吸附具有自发、吸热和熵增的特性。目前，市场上销售的花生的产地来源较多，质量参差不齐，难以保证相应的产品质量，通过调查发现，新昌小京生是全国稀有的炒食花生优质品种，其色、香、味俱佳，经济价值较高[8]，但有关其成分分析的研究鲜见报道。近年来，HPLC指纹图谱作为一种研究复杂物质体系的技术手段，被广泛用于质量控制等方面，具有快速准确等特点[9]。指纹图谱技术源于指纹鉴定学，中药指纹图谱通常是指能表达中药有关化学成分的特征谱图[10]，按照测定手段可分为化学指纹图谱和生物指纹图谱两大类[11-13]。通常得到的指纹图谱相当复杂，人工比较难免影响结果的准确性，若将其与计算机图谱解析和识别技术结合起来，其应用前景将大为扩展[14-15]。虽有相关报道对花生壳成分进行了初步探索[16-17]，但未利用HPLC指纹图谱对共有化学特征峰等进行统计学分析，信息也十分有限。本实验采用HPLC法对8个产地不同品种的花生壳进行指纹图谱研究及模式识别，以期为花生壳及其相关产品的质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

选用8个花生品种作为研究材料，其产地及品种信息见表1。

Agilent 1100系列液相色谱仪，配有二极管阵列检测器(Agilent公司，美国)；Milli-Q超低有机物型纯水系统(Millipore公司，美国)；高速离心机LG10-2.4A(北京时代北利离心机有限公司)；紫外分光光度计L6S(上海仪电分析仪器有限公司)；电子天平PL402-L(梅特勒-托利多仪器有限公司)；JK-100型超声波清洗器(合肥金尼机械制造有限公司)；C型30玻璃仪器快速烘干器(长城科工贸有限公司)；GM-0.33A隔膜真空泵(天津市津腾实验设备有限公司)乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸和其他试剂为分析纯，实验用水为超纯水。所用溶液使用前均用0.22 μm滤膜过滤。

1.2 提取工艺

分别称取8种花生壳各5.0 g，置于100 mL锥形瓶中，用量筒量取100.0 mL的甲醇加入锥形瓶，用保鲜膜封住瓶口，浸泡12 h后，将锥形瓶放入超声波清洗器中超声30 min，然后在4 000 r·min-1的条件下离心10 min，取上清液即得。

1.3 色谱条件

WondaCract ODS-2 C18(5 μm×4.6 mm×150 mm)色谱柱。流动相为0.5%磷酸溶液(A)和乙腈(B)；洗脱程序：0～10 min，80%～70% A；10～20 min，70%～60% A；20～35 min，60%～30% A；35～45 min，30%～20% A；45～55 min，20%～30% A；流速1 mL·min-1；柱温35 ℃；进样量10 μL。

1.4 实验条件的选择

1.4.1 提取溶剂的选择

称取S6花生壳5.0 g，取3份，各置于100 mL锥形瓶中，分别加入相同体积的甲醇、乙醇、乙腈，浸泡12 h后，超声30 min，在4 000 r·min-1的条件下离心10 min，取上清液过滤，在1.3节的的色谱条件下分别进样分析，确定提取溶剂的类型。上述不同溶剂提取实验进行3次平行实验，数据取平均值。

表1 供试花生的产地及品种

1.4.2 色谱分析波长及流动相的选择

根据1.2节中的方法分别制备8种花生壳的供试样品溶液，将样品溶液分别置于比色皿中，利用紫外可见分光光度计采集样本光谱，扫描波长范围为200～600 nm。每个样品采集1次，扫描次数1次。上述8种花生壳提取实验进行3次平行实验，数据取平均值。

为了确定好的分离条件，分别考查甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸、甲醇-0.5%磷酸溶液的流动相对色谱分析结果的影响，从而最终确定实验的流动相。

1.5 方法学考查

1.5.1 精密度实验

取S6样品供试液，连续进样6次，以峰值最高的3个峰为参照峰，计算各共有峰相对峰面积的相对标准偏差(RSD)，以考查实验方法的精密度。

1.5.2 稳定性实验

取S6样品供试液，在1.3节色谱条件下分别在0、2、4、6、8 h下进行含量测定，记录峰面积并计算峰面积测定结果的RSD，以考查实验方法的稳定性能。

1.5.3 重复性实验

取S6样品供试液，按供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，在1.3节色谱条件下测定，记录峰面积并计算测定结果的RSD，以考查实验方法的重复性能。

1.6 指纹图谱的数据处理

1.6.1 相似度分析

分别将8种花生壳样品的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)软件里，以生成的特征指纹图谱共有模式为对照，计算各样品的相似度，考查色谱峰的一致性。

1.6.2 系统聚类分析

系统聚类分析能够揭示样品间的关系，继而对样品进行分类，能提供的图谱信息较多，可作为中药指纹图谱应用于质量控制的补充，这将在中药材质量控制及综合评价分析中发挥作用。本实验采用SPSS 20.0统计软件，以相对峰面积为变量，对8个产地不同品种的花生壳做聚类谱系图，进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 实验条件的确定

2.1.1 提取溶剂

在乙醇、甲醇、乙腈3个溶剂的色谱分析结果中，以甲醇提取的色谱峰数目最多，效果较好，所以实验采用甲醇为提取溶剂。

2.1.2 色谱流动相确定

在以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸、甲醇-0.5%磷酸溶液为流动相的色谱分析比较实验中，发现乙腈-0.5%磷酸溶液作为流动相时，各峰分离效果较好，色谱峰形较好，经多次实验得出较为理想的梯度洗脱条件，故选择乙腈-0.5%磷酸溶液作为实验的流动相。

2.1.3 色谱分析的波长

本实验用紫外分光光度计采集样本光谱，见图1。由图1可知，8种样品溶液在200～404 nm有较强的吸收，在230和290 nm处吸收峰较高，但由于230 nm处波长较短，溶剂效应较强。预实验发现，波长为290 nm时色谱峰的数目最多，所以实验采用的色谱分析波长为290 nm。

2.2 花生壳指纹图谱的建立

对8种花生壳进行记录，测定色谱图，并利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A对8种花生壳样品的图谱数据进行分析，设置S2为参照指纹图谱，采用多点校正后进行匹配，建立8种花生壳的HPLC共有模式图，结果见图2和图3。由图2可见，8种花生壳指纹图谱共有14个共有峰。8种花生壳的供试品图谱与对照指纹图谱相似度依次为0.761、0.940、0.909、0.987、0.989、0.992、0.989、0.931，说明8个品种的花生壳总体上相似度较高，只有新昌小京生花生壳(S1)相似度稍低。

2.3 系统聚类分析

以8种花生壳指纹图谱的14个共有峰的相对峰面积(表2)为变量，用SPSS 20.0数据系统分析软件对其进行系统聚类分析，选用组间联接聚类方法，采用欧式距离度量标准，计算样品的相似性程度，聚类结果见图4。结果表明，8种花生壳可分为两大类：绍兴新昌小京生、嵊州小红毛、云南七彩、江苏大白鲨花生壳(S1、S2、S3、S8)为一类，江苏鲁花十一号、山东黑玉珍、山东平度富硒黑皮、山东改良海花一号花生壳(S4、S5、S6、S7)为另一类。前一类在地域上并无明显一致性，但这类花生大多较为瘦小，壳薄质轻，另一类除鲁花十一号以外均产自山东，并且这类花生较为粗大，果实饱满。

图1 样品紫外光谱扫描图Fig.1 UV spectrogram of sample

图2 八种样品HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints of 8 samples

图3 花生壳对照指纹图Fig.3 Peanut shell contrast fingerprints

表2 共有峰的相对峰面积

1～14号峰的保留时间依次为1.5，2.4，4.5，5.2，5.5，6.1，6.9，9.6，13.4，14.5，19.9，25.5，26.0，36.6 min。

The retention time of Peak 1-14 were 1.5，2.4，4.5，5.2，5.5，6.1，6.9，9.6，13.4，14.5，19.9，25.5，26.0，36.6 min, respectively.

图4 8种花生壳的聚类树Fig.4 Cluster tree of 8 kinds of peanut shells

2.4 方法学评价

2.4.1 精密度

在实验条件下按精密度实验评价方法测定样品S6的色谱峰，以峰值最高的3个峰为参照峰，结果见表3。结果表明，该方法具有良好的精密度与准确度。

2.4.2 稳定性

取S6样品供试液，在1.3节色谱条件下分别在0、2、4、6、8 h下进行含量测定，记录相对峰面积，结果见表4。结果表明，该方法具有良好的稳定性。

2.4.3 重复性

取S6样品供试液，按供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，在1.3节色谱条件下测定，记录相对峰面积，结果见表5。结果表明，该方法具有良好的重复性。

表3 精密度实验结果

表4 稳定性实验结果

表5 重复性实验结果

3 结论

本实验通过HPLC得出8个产地不同品种的花生壳的色谱图，建立了测定的色谱条件，并且对8种花生壳进行指纹图谱研究，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，通过相似度、系统聚类分析方法，对不同品种进行鉴别研究。结果表明，8个品种主要分为2大类：绍兴新昌小京生、嵊州小红毛、云南七彩、江苏大白鲨花生壳为一类；江苏鲁花十一号、山东黑玉珍、山东平度富硒黑皮、山东改良海花一号花生壳为另一类。该HPLC指纹图谱检测方法简便快捷，重现性好，可用于花生的质量控制，能够实现对不同品种花生的初步鉴定。