北京地区鸭源大肠杆菌耐药表型和Tet aac耐药基因的检测

刘砚涵,陈诗佳音,冯献程,夏兆飞

（中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193）

大肠杆菌是导致肉鸭细菌性疾病的重要细菌之一,其发病率呈上升趋势。由于大肠杆菌的血清型众多,极易形成耐药性,再加上养殖户对抗生素的滥用,导致鸭源大肠杆菌的耐药谱不断扩大。与此同时,鸭源大肠杆菌的耐药性会造成抗生素疗效欠佳,严重影响了肉鸭疾病的治疗以及公共卫生。然而,国内仅有几篇对肉鸭源大肠杆菌耐药基因检测的文献报道,北京地区的肉鸭源耐药基因资料更是缺乏。根据文献,携带耐药基因是细菌产生耐药性的重要原因,造成对氨基糖苷类药物耐药性的主要是编码氨基糖苷类钝化酶的基因,以aac基因最为常见;造成对四环素药物耐药性的主要是编码四环素外排泵的基因,即Tet基因[1-2]。由于文献报道大肠杆菌对四环素耐药严重,而氨基糖苷类药物是笔者采集样本的养殖场常用的抗生素,因此本研究选取了5种Tet基因和2种aac基因进行检测,并对Tet和aac两类耐药基因的携带情况与耐药表型之间的关系进行分析,以期为指导养殖户合理使用抗生素和临床耐药性监测提供依据,并为进一步研究耐药性的传播机制奠定基础。

1 材料

1.1 主要材料 巧克力培养基、麦康凯琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基、普通营养琼脂培养基及MH琼脂培养基,购自北京智博鼎盛生物技术有限责任公司;药敏纸片,均购自杭州天和微生物试剂有限公司;EasyPure Genomic DNA Kit、Trans 2K DNA Marker、2 ×Easy Taq PCR Super Mix,购自北京全式金生物技术有限公司;16S rDNA通用引物以及耐药基因引物由北京奥美德诺生物技术公司合成。质控菌为大肠杆菌标准株（ATCC 25922）。

1.2 样品来源 病料来自北京市大兴区、顺义区和延庆区的16个鸭场,共53份病料。

2 方法

2.1 分离培养 无菌环境下取病死鸭的肝脏,带回实验室,分别划线接种于麦康凯琼脂培养基、LB琼脂和三糖铁琼脂斜面培养,37℃培养18～24 h,观察细菌生长情况及菌落特征。

2.2 细菌纯化 取初步分离的单菌落,划线于麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝培养基上,37℃培养24 h。

2.3 细菌形态学观察 取用接种环勾取纯化的菌株,单菌落涂片,革兰染色、镜检。

2.4 分离菌16S rRNA分子和耐药基因的鉴定取纯化培养的细菌悬液,用EasyPure Genomic DNA Kit提取基因组DNA作为PCR模板;采用通用引物扩增细菌的16S rRNA,预期大小约为1 500 bp;PCR 扩增体系（40 μL）:2 × EasyTaq PCR Super Mix 20 μL,ddH2O 14 μL,上、下游引物各 2 μL,DNA 模版2 μL;PCR程序:95℃,10 min,95℃,30 s,56℃,30 s,72℃,1 min,32个循环;72℃,8 min[3]。扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统观察并记录结果。

用表1所示的引物对分离菌株进行耐药基因检测。 PCR 扩增体系（20 μL）:2 ×EasyTaq PCR SuperMix 10 μL,ddH2O 7 μL,上、下游引物各 1 μL,DNA模版1 μL;PCR程序:94℃,10 min;94℃,30 s;54℃,30 s;72℃,1 min;35个循环;72℃,8 min。扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像

系统观察并记录结果。

2.5 药物敏感性试验 在无菌条件下挑取经16S rRNA鉴定的单菌落,接种于灭菌的普通营养培养基中,37℃震荡培养至指数生长期。取细菌培养液100 μL均匀涂布于普通营养琼脂平板上,将药敏纸片贴到涂好菌液的平板上,37℃培养12 h,测量抑菌圈直径大小,根据美国CLSI手册判定药物的敏感性[4]。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,对于扩增片段大小与预期片段相符的,将PCR产物送奥美德诺生物技术公司进行测序,并将测序结果在 NCBI上与已知标准序列进行比对,从而鉴定细菌种属和耐药基因亚型。

表1 PCR扩增引物

3 结果

3.1 培养结果 53份病料共分离出30株大肠杆菌。分离菌在LB琼脂平板上为表面光滑、圆形隆起、边缘整齐、半透明的灰白色菌落;在麦康凯琼脂平板上为光滑湿润、圆形隆起、边缘整齐的粉红色中等大菌落;在三糖铁琼脂斜面底层由红色变为黄色、产气、斜面也变黄。同时革兰染色镜检,可看到红色、两端钝圆的短杆菌,多数为单个存在,少数成对出现。

3.2 药敏试验结果 从表2中可以看出,30株细菌对32种抗生素耐药性检测发现,分离的鸭源大肠杆菌耐药情况严重,青霉素、苯唑西林、四环素、克林霉素和利福平的耐药率达到100%;氨苄西林、阿莫西林、多西环素、链霉素、氯霉素和复方新诺明的耐药率达到75% 以上,其中氨基糖苷类中卡那霉素和链霉素耐药严重,而阿米卡星不耐药;同时,从表3中可以看出,分离的大肠杆菌多重耐药情况严重,分离菌均对6种及以上抗生素表现出耐药,其中对11种及以上抗生素表现出耐药性的菌株占76.7%（23/30）,对21种及以上抗生素表现出耐药的菌株占16.7%（5/30）。

表2 鸭源大肠杆菌药敏试验结果

表3 鸭源大肠杆菌多重耐药结果

3.3 耐药基因检测结果 30株鸭源大肠杆菌中,29株大肠杆菌携带四环素耐药基因Tet,检出率为96.7%。5种 Tet基因中 Tet（B）检出率最高,为63.3%,Tet（A）次之,为 60.0%,Tet（C）、Tet（M）的检出率分别为30.0%、13.3%,未检出Tet（K）。携带1种Tet耐药基因的占40.0%,同时携带2种、3种、4种的分别占40.0%、10.0%和6.7%,不存在同时携带5种耐药基因的菌株。从表4中可以看出四环素耐药基因Tet和耐药表型的关系,携带不同的Tet基因类型,四环素和多西环素耐药的表型也不同。

从表5中可以看出,30株鸭源大肠杆菌中,15株检出aac耐药基因,检出率为50.0%,其中 aac（3）-Ⅱc的检出率为26.7%,aac（6′） -Ⅰb的检出率为36.7%,同时携带两种耐药基因的菌株4株,占13.3%。同时,分离菌耐5种抗生素的个数不同,能检出的acc耐药基因也不尽相同。

4 讨论

由于乱用、滥用抗菌药物的现象在基层肉鸭养殖厂屡见不鲜,是造成鸭源大肠杆菌耐药的重要原因之一。这不仅会影响疾病的治疗,更加关系到人的安全,例如已有报道称从养殖者和禽体内同时分离出相同的特定菌株,说明耐药微生物或质粒可在家禽和人之间传播[5]。本试验发现,所有大肠杆菌均表现出对5种以上抗生素的耐药性,大部分对10种以上抗生素表现出耐药性。其中,对青霉素类和四环素类抗生素的耐药率最高,均大于85%,对碳青霉烯类、β内酰胺酶抑制剂复合物、大环内酯类抗生素耐药率较低。Wang[6-7]等对中国非人源的大肠杆菌耐药性分析发现,其对四环素耐药率最高,为66%,对氨苄西林耐药率次之,为57%。刁有江[8]等对山东省分离鸭源大肠杆菌检测发现,70%以上的大肠杆菌对氨苄青霉素、阿莫西林和多西环素耐药,78.26%的分离株对8种或8种以上的受试药耐药。可见对于不同来源、不同地区的大肠杆菌,其耐药性都很高,与本研究结果相似。同时本研究中鸭源大肠杆菌不仅对单一抗生素表现耐药性多重耐药的情况也很严重,提示对于大肠杆菌病的治疗,进行抗生素药敏试验的筛查有一定的必要性。

表4 四环素耐药基因Tet和耐药表型的关系

表5 氨基糖苷类耐药基因aac和耐药表型的关系

我国对肉鸭四环素类耐药基因的检测较少。方志超[9]等对重庆地区40株鸭源致病性大肠杆菌的四环素类耐药基因TetB、TetA、TetC、TetD的检出率分别为80.0%、75.0%、55.0%、15.0%,TetK和TetL的检出率均为0%,TetB基因的检出率最高。Shin[10]等对韩国鸭源大肠杆菌携带耐四环素基因检测中,Tet（A）携带率为 46.5%,Tet（B）次之为45.1%,Tet（C） 为 5.8%,Tet（A）的携带率最高。许瑞等[11]发现Tet耐药基因中,Tet（B）与四环素类耐药性表型相关性较好,与本研究结果相似。

本研究中,鸭源大肠杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药率为0% ～86.7%,其中链霉素耐药率最高,庆大霉素和阿米卡星耐药率最低,可能与养殖场使用链霉素较多,较少使用庆大霉素和阿米卡星有关。孙慧等[12]对禽源大肠杆菌氨基糖苷类耐药性检测发现,对链霉素、庆大霉素、卡那霉素和阿米卡星的耐药率分别为84.4%、57.1%、55.8%和40.2%,链霉素的耐药性最高与本研究结果一致,其他抗生素与本研究有一定的差异性,可能与使用频率有关。本研究中,绝大部分分离菌只耐1～2种氨基糖苷类抗生素;耐药基因aac的检出率也只有36.7%,只有aac（3） - Ⅱc、aac（6′） - Ⅰb 是北京地区肉鸭大肠杆菌携带率较高的耐药基因。Nanarova[13]等发现氨基糖苷类乙酰化酶 aac（6′）和 aac（3）是导致智利和日本大肠杆菌氨基糖苷类耐药的主要基因。于学辉等[14]对鸭源致病性大肠杆菌氨基糖苷类耐药性和耐药基因分析显示,对链霉素的耐药率最高为60%可能与aac基因的携带相关。

细菌耐药性问题已经成为一个全球性关注的问题,目前有越来越严重的发展趋势。而由于缺乏合理用药的相关知识,养殖户只能凭借经验用药,而能够轻易地购买到各种药物则对这种局面也具有推波助澜的作用,因此畜禽菌株的耐药性很大程度上是养殖过程中不规范使用抗菌药物产生的不良后果,对畜禽疾病的防治和人类健康都有较大的威胁。因此,我们应结合药敏试验科学地选用抗菌药物,并在规定的使用物种、剂量、期限等范围内使用,同时养殖户在用药时一定要咨询相关兽医技术人员,在其指导下合理用药。