2016-2017年江苏泰州地区单核细胞增生性李斯特菌流行现状监测

颜 卫,丁立军,卢劲晔,沈晓鹏,周媛丽

（江苏农牧科技职业学院 ,江苏 泰州 225300）

单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes,L.monocytogenes）是一种兼性胞内寄生菌,可引起人和多种家畜家禽的李斯特菌病。该病发病率低,致死率达到20% ～30%。易感人群主要为孕妇、新生儿、老年人、免疫力低下人群,会出现流产、脑膜炎、败血症及多器官功能障碍等。动物李斯特菌病以中枢神经系统感染为主,初期有精神沉郁、食欲不振、发热等症状,几天后会出现脑膜炎症状。动物的发病主要与食用污染的饲料有关,病原菌经过污染农场、食品加工、销售传染给人。李斯特菌病在欧美国家曾多次暴发流行,我国也有L.monocy togenes在畜禽和人之间暴发的报道[1]。作为四大食源性病原菌之一,从食物、人群、动物3个维度对产单核细胞李斯特菌的流行现状进行监测,及时的风险预警具有重要的公共卫生学意义。

1 材料与方法

1.1 培养基与试剂 李斯特增菌培养基,购自BD公司;李斯特选择培养基OXFORD、纯培养基BHI,均购自 OXOID 公司;Buffer、dNTPs、Taq酶、低分子量DNA Marker,购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 样品来源 2016年8月-2017年7月在江苏泰州地区采集医院病人脑脊液样品、猪场和羊场动物样品、超市、农贸市场、餐饮店食品样品共946份进行单核细胞增生性李斯特菌的检测。棉拭样品用Cary-Blair运送培养基,其余样品置于4℃冰盒6 h内送达实验室检测。

1.3 L.monocytogenes的分离 Carry-Blair培养基中取出的棉拭样本、食品类固体样本1 g剪碎、液体样本1 mL,加入9 mL增菌培养基LEB中培养24 h,挑取增菌液划线接种于选择培养基OXFORD上培养24 h,选择疑似菌落（细小、湿润、黑色）接种纯培养基BHI,过夜培养,菌液用溶菌酶-蛋白酶K法提取基因组DNA,具体步骤为:250 μL菌液13 000 r/min离心10 min,上清液弃去,菌体用95 μL Buffer混匀后加入4 μL溶菌酶（50 mg/mL）孵育15 min,再加入1 μL蛋白酶K（20 mg/mL）稍许震荡后58℃孵育至菌液澄清,95℃加热8 min后离心取上清液进行PCR检测。

1.4 L.monocytogenes的鉴定 参照周晓辉的方法[2],以L.monocytogenes的毒力基因溶血素基因hly下游片段设计引物,PCR体系中各成分的量为:10 × Buffer 2.5 μL,MgCl21.5 μL,dNTPs 5 pmol/L,hly引物各 10 pmol/L,模板 DNA 3 μL,Taq酶0.2 μL,去离子水14.8 μL。 PCR 反应程序为:94 ℃2 min,95℃10 s,60℃30 s,72℃30 s,35个循环,72℃ 10 min。取8 μL PCR产物点样进行琼脂糖凝胶电泳,成像仪上观察结果,在850 bp处出现特异性条带的为单核细胞增生性李斯特菌阳性。

2 结果与分析

2.1 脑脊液样本L.monocytogenes的监测结果 从医院患者的脑脊液样本24份中未分离到L.monocytogenes。

2.2 动物源样本L.monocytogenes的监测结果 从动物养殖场采集样本263份,分离到L.monocytogenes 4株,阳性率1.52%。猪场健康猪鼻腔棉拭样本、肛拭样本87份,阳性样本1份,L.monocytogenes污染率1.15%;猪场环境样本61份,分离到 L.monocytogenes 1株,阳性率1.64%;羊场健康羊鼻腔棉拭样本、肛拭样本73份,阳性样本1份,L.monocytogenes污染率1.37%;羊场环境样本42份,分离到L.monocytogenes 1株,阳性率2.38%。

2.3 食源样本L.monocytogenes的监测结果 从农贸市场、超市和包括卤菜店、饮品店在内的餐饮店采集食物样本659份,分离到L.monocytogenes 26株,阳性率为3.95%。其中肉制品为采集自市场和超市的猪肉、牛肉、鸡肉,共137份,L.monocytogenes检出率12.41%;水产品样本包括来源于市场、超市的淡水鱼、虾、海水鱼177份,L.monocytogenes检出率2.26%;冷冻鱼糜制品包括火锅、麻辣烫食品中经常食用的鱼丸、虾丸、蟹肉棒58份,采集自超市,检出率1.72%;采集自卤菜店的熟肉制品包括消费者经常购买的猪肉、猪舌头、猪耳朵、鹅肉、鸡肉 51份,L.monocytogenes检出率3.92%;凉拌菜52份,分离率1.92%;通过现场、电话、网络订餐方式采集的外卖盒饭样品44份,分离到1株 L.monocytogenes,阳性率2.27%;蔬菜、乳制品、果汁中未检测到L.monocytogenes,具体数据如表1。

表1 不同食物样品L.monocytogenes监测结果

依据采样地点不同,659份食物样品分别来源于农贸市场、超市和餐饮服务场所,包括针对不同消费群体的卤菜店、饮品店、快餐小吃店、餐馆等,L.monocytogenes检出率如表2,检出率最高的为市场样品,236样品中分离到L.monocytogenes15株,阳性率6.36%;其次为超市样品,240份中阳性样品7份,阳性率2.92%;183份餐饮样品分离到L.monocytogenes4株,阳性率2.19%。

表2 不同采样地点L.monocytogenes检出情况

采集的10类食品分为即食食品和非即食食品两大类,其中即食食品包括熟肉制品、凉拌菜、乳制品、果汁、外卖盒饭5类;非即食食品包括生畜禽肉、淡水鱼虾、海鱼、冷冻鱼糜、蔬菜5类。表3结果显示221份即食食品中L.monocytogenes检出率为1.81%,438份非即食食品中L.monocytogenes检出率为5.02%,非即食食品的L.monocytogenes检出率高于即食食品。

表3 即食食品和非即食食品L.monocytogenes检出情况

不同季度样品的监测结果见表4,4个季度均有L.monocytogenes阳性样品检出,检出率依次为2.42% 、3.62% 、5.05% 、3.91% 。

表4 不同季度样品中L.monocytogenes检出情况

3 讨论

本试验脑脊液样本未分离到L.monocytogenes,这与样品采集范围不广,样品量不够大有关,此外,目前国内人群李斯特菌病多为散发,免疫功能低下者多表现为中枢感染,孕妇多见局灶感染,且感染的原因多为食源性的,可通过胎盘、产道感染胎儿,引起新生儿化脓性脑膜炎、败血症等。健康人群感染L.monocytogenes后,病原菌主要在肝细胞增殖,最终被T淋巴细胞介导的免疫应答清除[3]。感染的确诊有赖于血液、脑脊液等的微生物学检测,早期选择有效的抗生素,如氨苄西林或大剂量青霉素[4],也可选用万古霉素、碳青霉烯类等可以改善预后,降低死亡率。

L.monocytogenes在自然界广泛存在,多种动物均可感染,其中猪感染病例报道较多,其次为羊。本研究在健康猪群、羊群、环境中均分离到L.monocytogenes,虽然未发生动物疫情,但环境中的致病菌对动物群仍构成威胁,是引起疫病的隐患。动物李斯特菌病的发生主要与食用污染的贮存饲料有关,霉变、低酸度劣质青贮是L.monocytogenes的主要贮存场所,往往会引发羊群暴发李斯特菌病。试验中采样的养殖场饲料质量过关,羊群饲喂干草。提高饲料质量,减少动物群密度,保障动物一定量的运动,同时按操作规程加强养殖场环境管理,定期消毒是保证动物群健康的有效措施。

食源样本中L.monocytogenes污染率为3.95%,10类食品中生畜禽肉的阳性率最高,达到12.41%,说明在畜禽屠宰、加工、销售环节还需要进一步加强监管。首先从宰前饲养环境抓起,环境的定期消毒非常重要。生产过程中畜禽胴体产品和肠道产品可采取分开处理的方式,控制内脏冲洗对胴体和环境的污染,肉品保存的冷库环境也不容忽视,与其他食源性人兽共患病原菌不同,L.monocytogenes对生存温度要求广泛,低温下仍生长良好,这一特性提示了冷库肉品也有被污染的可能。流通环节的自然环境、污水、切割器具、接触器皿、被污染的其他生熟食品都是造成或加重肉制品污染L.monocytogenes的原因。水产品中淡水鱼虾污染率1.90%、海鱼污染率2.78%,可能是由于冷藏运输过程中L.monocytogenes增殖或发生二次污染。冷冻鱼糜制品（鱼丸、虾丸、蟹肉棒等）污染率1.72%的原因有3个方面:（1）原料即水产品的污染;（2）加工过程的污染,经过切割、绞碎、搅拌等步骤,设备、人员、环境会造成交叉污染,运输、销售过程也会受到人员污染;（3）存贮温度不达标,存在敞口销售、反复冻融等现象,未按照标准全程冷链。即食食品的污染率1.81%,提示在食品加工过程中要严格按照规范进行操作,生熟食分开,同时生熟食的加工用具也要分开。目前,全国范围内餐饮即食食品的微生物标准正在制定,江苏已经建立了相关的地方标准[5]。试验监测到熟肉制品L.monocytogenes污染率达到3.92%,熟肉制品的销售过程基本开放,销售时间较长,有的卤菜摊点不防尘、无消毒、无冷藏,这些都会造成食物的二次污染,引起致病菌的增殖。从外卖盒饭中分离到L.monocytogenes说明餐饮店还需要从原料监管、设施管理、人员培训、卫生安全意识强化等方面着手进一步提高食品安全管理水平,同时需要加强对网络订餐平台的运营监管。不同采样地点的检出情况比较显示,市场检出率最高6.36%,这与卫生条件、储藏条件相对较差、人口密集有关,需要加大对市场的监管力度,提高个体经营者的食品卫生安全意识,定期进行卫生知识培训。