牛可食性组织中加米霉素残留量的液相色谱-串联质谱检测方法的研究

王艳艳,王红霄,邓 菲

（华北制药集团动物保健品有限责任公司,河北 石家庄 050041）

加米霉素（Gamithromycin）,是一种新型的半合成大环内酯类动物专用抗生素[1],通过与敏感菌核糖体的50S亚基不可逆的结合,使肽酰tRNA解离进而阻断肽链的合成进而影响蛋白质的合成,最终达到抑菌和杀菌的作用。该药由法国梅里亚有限公司研制,其商品名为Zactran（规格:150 mg/mL）,2007年9月经欧盟批准用于靶动物牛[1],2016年2月经欧盟批准用于靶动物猪[2]。在国外已被用于预防和治疗非泌乳牛和猪的呼吸系统疾病[1-2],并取得了良好的效果。作为第二代大环内酯类抗生素的代表药物之一,其具有抗菌谱广、抗菌活性强、动物专用、单次给药、吸收迅速、生物利用度高、低残留、安全高效等优点,在畜禽养殖生产中具有非常广阔的应用前景。

目前,动物源性食品中加米霉素残留量的检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。高效液相色谱法因其重复性较好、成本低、定量准确以及受样品基质影响小等优点,在一段时间内被用于加米霉素的定量检测[3]。但由于加米霉素紫外吸收弱且吸收波长（215 nm）与流动相中的甲醇（190 nm）、乙腈（205 nm）相近,从而限制了高效液相色谱法的应用。液相色谱-质谱法（LCMS）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）为加米霉素的检测提供了更加灵敏、可靠、快捷的手段[4]。本文建立了其在牛可食性组织中残留量的UPLCMS/MS方法。

1 试剂与材料

1.1 试剂 加米霉素（Trc公司;纯度为95%）;加米霉素-d5（内标）（Trc公司;纯度为95%）;超纯水（Milli-Q超纯水仪制取）;乙腈、甲醇均为色谱纯（Merck公司）;甲酸、正己烷、磷酸二氢钾、氨水均为国产分析纯;Oasis HLB固相萃取柱（Waters公司;60 mg）; 滤膜（Pall公司,0.2 μm）;硅藻土（Sigma公司,CeliteR545）。

1.2 试剂的配制 0.1mol/L磷酸二氢钾缓冲液:称取磷酸二氢钾13.60 g,溶于1 000 mL水中。

5%氨化乙腈-甲醇（7∶3,v/v）:取氨水5 mL,用乙腈 -甲醇（7∶3,v/v）稀释100 mL。

加米霉素标准储备液（1 mg/mL）:准确称取加米霉素标准品适量,于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,配成浓度为1 mg/mL的标准储备液。 -20℃贮藏,有效期6个月。

加米霉素-d5内标储备液（100 μg/mL）:准确称取加米霉素-d5标准品适量,于5 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,配成浓度为100 μg/mL的标准储备液。 -20℃贮藏,有效期6个月。

加米霉素标准工作液（10 μg/mL）:取 0.5 mL加米霉素标准储备液于50 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度。 -20℃贮藏,有效期6个月。

加米霉素 -d5内标工作液（1 μg/mL）:取0.1 mL加米霉素-d5内标储备液于10 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度。-20℃贮藏,有效期6个月。

2 仪器和设备

高效液相色谱仪-串联质谱仪（Agilent Technologies 6430）;高速冷冻离心机（Sigma公司）;氮吹仪（美国Organomation公司）;旋涡混合器（IKA公司）。

3 测定方法[4-10]

3.1 样品提取净化 取1 g动物组织,加入适量的标准溶液和内标溶液,涡动15 s,静置15 min,加入10 mL 0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲液涡动1 min,9 000 r/min离心10 min,收集上清,残渣用10 mL磷酸二氢钾缓冲液重复提取一次;合并上清液,备用。

采用HLB固相萃取柱进行净化。预先在HLB小柱上方加入0.2 g硅藻土,依次用3 mL甲醇、3 mL水进行活化,取备用液10 mL上柱,并确保溶液缓慢流过HLB柱（必要时可采用真空泵）。然后用3 mL 5%氨水、3 mL甲醇∶水（70∶30,v/v）进行洗涤。 用3 mL乙腈∶甲醇（70∶30,v/v,含5%氨水）溶液洗脱。 洗脱液于40℃水浴氮气下吹干。用1 mL甲醇∶水（50∶50,v/v）溶液复溶,涡动1 min;加入3 mL正己烷涡动1 min,10 000 r/min离心5 min,弃正己烷,过0.2 μm滤膜,供高效液相色谱-串联质谱法测定。

3.2 标准曲线的测定 在空白的牛组织基质匹配液中,添加不同量的加米霉素,绘制加米霉素的标准曲线。 配制成加米霉素浓度为 5、10、20、100、250、500 μg/L,而加米霉素 -d5 浓度为 100 μg/L的系列基质匹配标准工作液,供液相色谱-串联质谱法测定。以测得的加米霉素及内标的定量离子质量色谱峰面积之比为纵坐标,对应的加米霉素浓度为横坐标,绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

3.3 空白组织添加样品的制备 在1 g空白的牛组织中添加不同量的加米霉素及相同量的加米霉素-d5。工作溶液制备空白添加样品,对应每个组织中的加米霉素的4个浓度。每种组织每个浓度3个批次,每个批次6个平行。这些样品用于检查分析方法的灵敏度、分析物的保留时间及评价相对回收率和变异系数。见表1

表1 牛空白组织中加米霉素添加样品的制备

3.4 色谱条件 色谱柱:Luna C18,2.1×50 mm,5 μm;流动相:A相为0.1%甲酸水溶液;B相为0.1%甲酸乙腈溶液;流速:0.25 mL/min;柱温:30 ℃ ;进样量:5 μL。

梯度洗脱:梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱条件

3.5 质谱条件 离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测;电离电压:3.0 kV;雾化温度:350℃;雾化气流速:540 L/h。

测试药物定性、定量离子对及对应的裂解电压、碰撞能量见表3。

表3 加米霉素的定性、定量离子及裂解电压、碰撞能量

3.6 定量测定 取试样溶液和相应的基质匹配标准工作液,按内标法定量,标准工作液及试样溶液中的加米霉素的响应值均应在仪器检测的线性范围内。方法学验证时的添加回收样品,采用单点校正的方式定量。

3.7 计算 标准曲线的拟合采用最小线性二乘法,准确度和精密度的计算采用单点校正法。

4 结果

4.1 标准曲线 各组织标准曲线回归方程和相关系数,见表4。

表4 标准曲线线性验证结果

4.2 灵敏度 在空白组织中添加不同浓度的加米霉素,测定信噪比（S/N）≥3时为检测限,S/N≥10时为定量限。本方法对于牛肌肉、肝脏、肾脏和脂肪添加浓度为1μg/kg时其信噪比（S/N）分别为:9.1、8.3、14.1、22.3;本方法对于牛肌肉、肝脏、肾脏和脂肪添加浓度为2 μg/kg时其信噪比（S/N）分别 为:28.4、31.5、36.9、38.2,平 均 回 收 率93.56%～103.89%,批内变异系数1.82%～8.68%,批间变异系数2.79% ～6.70%,故定量限均可设定为 2 μg/kg。

4.3 准确度和精密度 取表1制备的空白添加样品,按上述方法处理、测定后,计算组织样品中加米霉素的回收率和变异系数。组织样品的回收率结果见表5、表6,变异系数结果见表7、表8。

表5 牛肌肉和猪肝脏中加米霉素的回收率/%

表6 牛肾脏和牛脂肪中加米霉素的回收率/%

表7 牛肌肉和牛肝脏中加米霉素的变异系数/%

表8 牛肾脏和牛脂肪中加米霉素的变异系数/%

5 结论

本试验建立了一种快速、可靠的“牛组织中加米霉素残留量测定-高效液相色谱串联质谱法”,在牛肌肉、肝脏、肾脏、脂肪中的加米霉素的检测限均可设定为1 μg/kg,定量限均可设定为2 μg/kg,基质匹配标准曲线范围为 5 μg/L～500 μg/L,相关系数 ＞0.99;牛肌肉和肾脏组织在2、50、100、200 μg/kg 四个添加浓度的平均回收率为93.56% ～103.31%,批内变异系数≤8.67%,批间变异系数≤6.70%;牛肝脏组织在2、100、200、400 μg/kg 四个添加浓度的平均回收率为94.37% ～102.52%,批内变异系数≤5.70%,批间变异系数≤4.61%;牛脂肪组织在2、10、20、40 μg/kg四个添加浓度的平均回收率为100.95% ～105.58%,批内变异系数≤5.89%,批间变异系数≤4.52%;该方法样品处理方法简便、灵敏度高,适用于牛可食性组织中加米霉素的残留监测。