荔枝酒制备过程中DDMP生成的适宜条件及变化规律

王桢昌，何荣荣，钟秋平*

（海南大学 食品学院，海南 海口 570228）

荔枝（Litchi chinensis）因其果肉柔嫩，含较高糖分、适量有机酸以及多种氨基酸，适合酿制荔枝果酒[1-2]。荔枝汁含有多酚类、黄酮醇、黄烷醇、花色苷等多种功能性成分[3]，在荔枝酒制备过程中经过复杂的加工处理破坏严重，导致荔枝酒产品特性不强、档次低[4-6]。2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮（2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4（H）-pyran-4-one，DDMP）是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在荔枝酒酿制过程中同步代谢过量醋酸时新发现的一种通过美拉德反应产生的带有焦糖风味的香气成分，具有极强抗氧化活性及生理活性[7-9]。据现有关于荔枝酒香气成分文献报道看，荔枝酒的香气成分包括醇类化合物、酸类化合物、酯类化合物、羰基化合物和苯环衍生物、萜烯类化合物、含硫化合物、醛类化合物及烃类化合物等[4]，在众多检出的香气化合物中，均未见DDMP。关于DDMP的研究，国内外的报道主要集中在还原糖-氨基酸体系高温下进行美拉德反应及一些高温热加工的食品[10-18]，而关于荔枝酒制备过程中DDMP生成的适宜条件及变化规律尚未见文献报道。因此，本研究以荔枝汁为发酵基质，探讨荔枝酒发酵制备中DDMP生成的适宜条件及变化规律，为荔枝酒中DDMP的生成调控提供理论及技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金澄无核荔枝：市售。

果胶酶（多聚半乳糖醛酸酶79%、果胶酯酶18%、果胶裂解酶3%）：法国rue des Briquetiers公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DV10、QA23、EC1118、R2、D254：上海杰兔工贸有限公司；焦亚硫酸钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DS-200型组织捣碎机：上海垒固仪器有限公司；HH4型数显恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司；ILRH-250A型生化培养箱：韶关泰宏医疗器械有限公司；AR124CN型电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；TG16-WS型高速离心机：湖南湘仪试验室仪器开发有限公司；PAL-1型手持糖度计：日本ATAGO公司；FE20型pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；T6型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；1260型液相色谱仪及6890-5975C气相色谱-质谱联用（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）仪：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 荔枝汁的制备

新鲜荔枝去皮、去核，打浆，添加0.25 g/kg果浆质量的果胶酶，40℃水解120 min，4 000 r/min离心20 min，得澄清荔枝汁，接种前添加200 mg/L的焦亚硫酸钠。

1.3.2 DDMP生成条件优化单因素试验

不同酵母对DDMP生成的影响：将制备好的荔枝汁，接入活化好的酿酒酵母DV10、QA23、EC1118、R2、D254，在20℃的温度条件下恒温发酵至质量恒定，探讨不同酵母对DDMP形成的影响。

发酵温度对DDMP形成的影响：将制备好的荔枝汁，接入活化好的酿酒酵母DV10，分别在15℃、20℃、25℃、30℃条件下恒温发酵至质量恒定，探讨发酵温度对DDMP形成的影响。

起始pH对DDMP形成的影响：将制备好的荔枝汁，分别调节pH值为3.0、3.5、4.0、4.5，接入活化好的酿酒酵母DV10，在20℃条件下恒温发酵至质量恒定，探讨起始pH对DDMP生成的影响。

发酵过程中DDMP的变化：将制备好的荔枝汁，接入活化好的酿酒酵母DV10，在20℃条件下恒温发酵，分别在发酵的第3天、第6天、第9天、第12天及第15天时取样检测DDMP的含量，探讨不同发酵时间DDMP的变化。

热处理及陈酿期间DDMP的变化：后酵完成后对荔枝酒进行热处理，在60℃条件下陈酿，分别在第10天、第30天、第60天、第90天及第120天时取样测定DDMP的含量，以室温陈酿的酒样为对照，考察陈酿期间DDMP的变化。

1.3.3 DDMP生成条件优化响应面试验

在单因素试验基础上，固定酵母为DV10、发酵温度20℃和陈酿温度60℃，以发酵起始pH（A）、发酵时间（B）和陈酿时间（C）3个因素为自变量，DDMP含量（Y）为响应值，因素与水平见表1。

表1 DDMP生成条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for DDMP production condition optimization

1.3.4 测定方法

采用气质联用法测定DDMP含量，AB-INowax弹性石英毛细管柱（30.0m×250μm×0.25μm）。柱温45℃（保留2min），以4℃/min升温至230℃，保持20 min；汽化室温度250℃；载气：高纯氦气（He）（99.999%）；柱前压5.08 psi，载气流量1.0 mL/min；进样量1 μL；溶剂延迟时间1.5 min。

电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增电压1 618 V；接口温度280℃；扫描质量范围20～450 amu。

对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist2008和Wiley275标准质谱图，确定DDMP成分，用峰面积归一化法确定DDMP的相对含量。

1.3.5 数据分析

所有分析数据为各组处理3次重复的平均值，利用SPSS 18.0进行方差分析（analysisofvariance，ANOVA），各平均值利用Duncan多重比较检验进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同酵母对DDMP生成的影响

荔枝汁中含有丰富的糖分和氨基酸，特别是利于DDMP生成的葡萄糖和脯氨酸含量较高，具备生成DDMP的物质基础[19-20]。不同酵母发酵对荔枝酒DDMP的生成情况见图1。

图1 不同酿酒酵母对DDMP生成的影响Fig.1 Effect of differentSaccharomyces cerevisiaeon DDMP production

由图1可知，酿酒酵母QA23、EC1118和R2发酵所得的荔枝酒中DDMP的生成量显著低于酵母DV10发酵所得的荔枝酒（P＜0.05），而酵母D254所酿制的荔枝酒中DDMP的含量略低于酵母DV10发酵的荔枝酒，但两者之间差异不显著（P＞0.05），说明酿酒酵母DV最适宜DDMP的生成。DDMP是糖和氨基酸通过羰氨反应形成的产物，不同的糖和氨基酸组合对DDMP的形成有一定影响。不同酵母利用糖和氨基酸的能力各不相同，导致形成DDMP的底物残留浓度有差异。从5种所测试的酿酒酵母形成的DDMP含量可知，酿酒酵母DV10可以比较有效的节约形成DDMP的底物，利于底物形成DDMP，而不是被酿酒酵母作用形成酒精、菌体蛋白及其他代谢产物。因此，选择酿酒酵母DV10进行后续试验。

2.1.2 发酵温度对DDMP生成的影响

发酵温度对DDMP形成的影响见图2。从图2可以看出，不同发酵温度样品的DDMP含量差异不显著（P＞0.05），表明发酵温度对DDMP的形成影响较小。温度是影响美拉德反应的关键因素，在以葡萄糖或果糖与氨基酸组合的高温固相反应体系中，温度的高低对DDMP的形成影响显著，150℃的温度处理比130℃的温度更加有利于DDMP的生成[10]。而荔枝酒发酵是在15～30℃的低温体系中进行的，与130℃及以上的高温相比，热力作用小，因而对DDMP的形成影响小。考虑到温度对酿酒酵母的发酵速度及荔枝酒风味的影响，采用20℃的发酵温度较为适宜，此发酵温度下DDMP相对含量为0.077 3%。

图2 发酵温度对DDMP生成的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on DDMP production

2.1.3 起始pH值对DDMP生成的影响

起始pH值对荔枝酒发酵中DDMP生成的影响见图3。由图3可知，起始pH3.5以上的荔枝汁发酵所得的DDMP含量与pH3.0的相比差异显著（P＜0.05），但起始pH3.5以上时样品间DDMP的生成量差异不显著（P＞0.05），说明适当调节发酵液的pH可以影响荔枝酒中DDMP的含量。可能的原因是在起始pH＜3.5条件下，较为显著地抑制了美拉德反应过程中葡基胺的形成，导致DDMP生成量的降低。因此选择起始pH3.5为宜。

图3 起始pH值对DDMP生成的影响Fig.3 Effect of initial pH value on DDMP production

2.1.4 发酵过程中DDMP的变化

发酵过程中荔枝酒中DDMP变化情况见图4。从图4可知，荔枝酒中DDMP的含量随发酵时间的延长逐渐增加。发酵9 d后的各酒样与发酵第6天、第3天的酒样之间DDMP的含量差异显著（P＜0.05）。与高温短时条件下的美拉德反应相比，低温条件下的美拉德反应发生缓慢，适当延长发酵时间有利于DDMP的生成。

图4 荔枝酒发酵过程中DDMP相对含量变化Fig.4 Changes of DDMP relative content during lychee wine fermentation

2.1.5 陈酿期间DDMP的变化

室温陈酿及热加速陈酿不同时间内DDMP的变化如图5所示。从图5可以看出，室温陈酿期间，DDMP的变化非常缓慢，只有陈酿90 d的酒样其DDMP的含量与0 d时相比差异显著（P＜0.05），其余时间之间均不显著（P＞0.05），说明室温陈酿对DDMP的影响有限；经过60℃温度处理后，DDMP的含量发生了显著变化（P＜0.05），与不经热处理的酒样相比，只有0 d时差异不显著外（P＞0.05），其余陈酿时间内两者均有显著差异（P＜0.05），其DDMP的含量随陈酿时间的延长逐渐升高，并在陈酿60d时达到最大值，随后略有降低，说明在热处理条件下陈酿时间对荔枝酒中DDMP有显著影响（P＜0.05）。因此，为了进一步提高荔枝酒中DDMP的含量，建议对荔枝酒进行热加速陈酿时间60 d为宜。

图5 不同陈酿时间对DDMP生成的影响Fig.5 Effect of different aging time on DDMP production

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验结果与方差分析

表2 DDMP生成条件优化响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiments for DDMP production conditions optimization

根据表2的试验结果，利用Design Experts 8.0软件对数据进行回归分析，拟合后得到DDMP含量（Y）与发酵起始pH值（A），发酵时间（B）和陈酿时间（C）的二次多项回归方程为：

Y=-0.665 8+0.267 6A+0.0352 3B+1.634 5E-003C-2.316 7E-004AC+1.750 0E-005BC-0.030 01A2-1.494 7E-003B2-8.891 7E-006C2

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

回归方程的方差分析见表3，由表3可见，模型（P＜0.0001）极显著，失拟项（P=0.5487＞0.05），不显著，决定系数R2=0.9942，表明该模型相关性好，预测值和实际值拟合度较好，变异系数（coefficient of variation，CV）转低为0.95%，各因素对DDMP含量影响的次序为起始pH值＞陈酿时间＞发酵时间。一次项中起始pH值和陈酿时间影响极显著（P＜0.01），发酵时间影响不显著（P＞0.05），表明发酵起始pH值和陈酿时间对DDMP生成的影响大。交互项中AC影响极为显著（P＜0.01），BC影响显著，表明发酵起始pH值和陈酿时间、发酵时间和陈酿时间存在交互作用。二次项A2、B2和C2的影响皆为极显著（P＜0.01）。

2.2.2 适宜条件的确定及验证试验

利用Design Experts 8.0软件，对所建立的回归数学模型进行优化，得到适宜制备条件为发酵起始pH4.2，发酵时间11.8d，陈酿时间48.3d，DDMP含量的理论得率0.1483%。为了方便实际生产，修正为发酵起始pH4.2，发酵时间12 d，陈酿时间48 d。在此条件下进行3次平行试验，实际测得DDMP相对含量的平均值为0.1512%，与理论值相差1.96%。可见，各工艺参数合理可靠，具有实际应用价值。

3 结论

不同酿酒酵母对荔枝酒中DDMP的含量有显著影响（P＜0.05），5种酿酒酵母中，DV10最有利于DDMP的生成；发酵温度对DDMP的生成没有显著影响（P＞0.05），从荔枝酒的口感及品质上考虑，采用20℃的发酵温度为宜；发酵起始pH值和发酵时间对DDMP的生成有影响，发酵时间长和较高起始pH的条件下较有利于DDMP的生成；酿制的荔枝酒在室温条件下陈酿对DDMP的生成几乎没有影响；热处理有利于DDMP的形成，且在热处理条件下陈酿时间对DDMP的形成有显著影响（P＜0.05）；通过响应面分析试验，进一步确定了适宜的发酵条件为发酵起始pH4.2、发酵时间12d、60℃陈酿时间48 d，在此条件下得到的DDMP含量为0.151 2%。