骨关节炎基因治疗的研究进展*

顾晓东车先达李鹏翠卫小春**

（1.山西医科大学第二医院骨科，太原030001；2.骨与软组织损伤修复山西省重点实验室，太原030001）

骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种中老年人常见的骨关节疾病，主要病理改变为关节软骨进行性破坏、继发性骨质增生，以及软骨下骨和关节囊及韧带、半月板等结构发生的病理改变[1]。早期OA可采用理疗、运动疗法等基础治疗，随着病情加重，可加用药物治疗；若病情进一步加重，在基础治疗和药物治疗无效时，可选择手术治疗[2]。随着基因治疗技术的发展及成熟，越来越多的基因被应用到OA治疗的研究中。OA基因治疗是将目的基因引入关节腔中，使目的蛋白在关节腔中能够可控、靶向并长期稳定表达，从而起到保护和修复受损关节软骨的作用[3]。本文对目前OA基因治疗的相关研究做一综述，阐述OA基因治疗的研究进展及未来研究方向。

1 OA基因治疗策略

关节软骨主要由软骨细胞及细胞外基质构成，缺乏血管、神经及淋巴管[4]。软骨细胞是一种高度分化细胞，主要功能为合成和分泌软骨基质蛋白，维持软骨基质新陈代谢。细胞外基质主要为Ⅱ型胶原、蛋白多糖和水[5]。OA发病早期表现为关节软骨细胞肥大样改变，细胞发生凋亡及坏死，肥大软骨细胞分泌软骨基质降解酶类，继而导致软骨细胞外基质降解、蛋白多糖丢失，关节软骨退变、破坏[6]。这个过程中还伴有滑膜炎症，导致IL-1、TNF-α等炎症因子释放，最终加剧关节软骨退变、破坏[7]。总之，由于关节软骨的基质合成和降解失衡，最终导致OA发生[8]。

针对上述OA发病机制，基因治疗目前主要包括减轻关节炎症、抑制软骨基质降解及促进软骨基质合成[9]。

1.1 减轻关节炎症和抑制软骨基质降解

白细胞介素-1β（IL-1β）是OA最为重要的炎症因子，可以导致关节软骨合成和降解代谢失衡，最终出现关节软骨破坏[10]。有研究显示，在OA发病过程中，关节滑液中IL-1β的含量增高，OA软骨细胞表达更多的IL-1受体[11]。白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1RA）是一种生理性的IL-1信号通路路抑制剂，可以与IL-1竞争性结合IL-1受体，但并不激活该信号通路，从而起到抑制IL-1的作用，因此可以延缓OA关节软骨的破坏[12]。Frisbie等[13]用腺病毒载体携带马IL-1RA基因，通过关节腔注射用于治疗实验性马OA，结果显示，IL-1RA基因在关节腔内可以持续表达近28 d，可以有效缓解疼痛、保护关节软骨、延缓OA进展。另一项研究采用腺相关病毒sc-rAAV2.5携带IL-1RA基因用于碘乙酸（mono-iodoacetate,MIA）诱导的大鼠OA的治疗，该研究证实了病毒携带基因用于OA治疗的安全性和有效性[14]。

NF-κB通路是主要的炎症通路，可以被IL-1、TNF-α等炎症因子激活，从而产生炎症级联反应，诱导大量细胞降解酶类、趋化因子等产生[15]，诱发关节炎症，破坏关节软骨。因此，有研究采用腺病毒介导NF-κBp65特异性siRNA（Ad-siRNANF-κBp65），在大鼠OA模型中，通过关节腔注射，抑制该信号通路的激活，抑制炎症反应及软骨分解酶类的产生，从而延缓OA关节软骨退变[16]。

低氧诱导因子-2α（HIF-2α）是软骨细胞分解代谢指标，在OA发生过程中，HIF-2α表达上调，并直接诱导基质金属蛋白酶（MMPs）、ADAMTS4等基质分解酶类产生，导致关节软骨破坏[17]。Pi等[18]采用小鼠OA模型，通过关节腔注射Hif-2α siRNA，靶向下调关节软骨中HIF-2α的表达，减少关节软骨分解酶类的产生，从而起到保护关节软骨的作用。

基质金属蛋白酶-13（MMP-13）是最重要的软骨降解酶类，可以降解Ⅱ型胶原及蛋白多糖，破坏关节软骨[19]。有研究采用MMP-13条件性基因敲除（Mmp13Col2ER）小鼠，阻断关节软骨细胞中MMP-13的表达。实验结果表明，在小鼠OA模型中，MMP-13基因敲除小鼠关节软骨中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达较野生型小鼠增加，关节软骨退变减轻[20]。

印度刺猬蛋白（Indian hedgehog,Ihh）在骨关节炎的发生发展中起重要作用。在人OA关节软骨及滑液中，Ihh的表达增加。上调的Ihh可以促进软骨细胞发生肥大样改变，并通过刺激Ⅹ型胶原和MMP-13的合成，导致关节软骨降解[21]。本课题组构建Ihh条件性基因敲除（Col2a1-CreERT2，Ihhfl/fl）小鼠，采用内侧半月板切除手术制备OA模型。结果发现，Ihh条件性基因敲除小鼠和野生型小鼠相比，其关节软骨中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量更高，而Ⅹ型胶原和MMP-13的含量降低，其关节软骨的损伤程度明显降低。这表明，通过抑制软骨细胞中的Ihh信号可以作为一种新的方式用于预防和治疗OA[22]。

1.2 促进软骨基质合成

由于软骨再生能力有限，因此各种促进软骨基质合成的生长因子，如TGF-β、IGF-1被应用于骨关节炎治疗的研究。由于TGF-β1在软骨发育和成熟中的关键作用，故一直备受关注[23]。InvossaTM是由逆转录病毒携带的TGF-β1转染的、经过辐照的同种异体软骨细胞和未转染、未经辐照的软骨细胞以1∶3的比例混合而成，多项动物实验证实该方法可以有效修复兔股骨髁软骨缺损[24,25]。Ⅰ、Ⅱ期临床试验验证了InvossaTM治疗中重度骨关节炎的安全性和有效性，其可以有效缓解患者疼痛及改善运动功能[26-28]。目前该药物在韩国已经被批准用于中度骨关节炎的治疗，Ⅲ期临床试验已经在美国开始进行[29]。

胰岛素样生长因子-1（IGF-1）亦被用于关节炎治疗的研究。在一项佐剂诱导的兔膝关节炎模型中，通过关节腔注射腺病毒介导的IGF-1，可以促进关节软骨蛋白多糖的合成而没有明显的毒副作用[30]。

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能刺激软骨细胞增殖分化，体外实验表明，腺病毒介导的bFGF可高效转染人OA软骨细胞。bFGF转染后可明显促进软骨细胞的增殖，同时增加软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成[31]；通过向兔OA模型膝关节腔注射重组腺病毒载体携带的bFGF，可以促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，延缓骨关节炎关节软骨的破坏[32]。

2 基因治疗递送系统

关节软骨结构致密，软骨细胞被大量细胞外基质包裹，因此各种递送系统必须能够穿过致密的关节软骨，将目的基因导入关节软骨细胞，起到治疗作用。目前最常用的载体有两种：病毒载体及非病毒载体[33]。

2.1 病毒载体

病毒载体是目前基因治疗最常用的递送系统，常用的病毒有腺病毒、慢病毒及腺相关病毒。

腺病毒（adenovirus）在体外对软骨细胞有接近100%的转染效率[34]，但腺病毒体内转染可以引起较为强烈的机体免疫反应，目的基因表达时间也较短，只有1～2周[35]。第三代腺病毒载体的出现克服了上述问题。有研究采用第三代腺病毒载体行小鼠膝关节腔注射，目的基因在关节内可以持续表达一年，采用第三代腺病毒载体携带PRG4基因治疗小鼠交叉韧带切断诱导的骨关节炎，单次注射就可以有效抑制关节软骨降解[36]。

慢病毒载体是由人类免疫缺陷I型病毒（HIV-1）改造而来，可以感染分裂及非分裂细胞，能够插入宿主基因组，使目的基因长期稳定的表达，对软骨细胞有高达95%的转染效率[37]。但由于慢病毒可以插入到宿主基因组中，因此可能有致瘤效应及引起宿主基因突变。同时，由于其由HIV病毒改造而来，可能会带来不良的心理问题[33]。

重组腺相关病毒载体（recombinant adeno-associated virus,rAAV）：由于移除了所有病毒编码序列，和腺病毒相比，其免疫原性低，可感染分裂及非分裂细胞，穿过致密的软骨细胞外基质转染软骨细胞，对软骨细胞的转染效率高达95%，表达时间可达150 d[33,38]。多项动物实验用rAAV携带目的基因治疗骨关节炎，证明了其较高的关节软骨转染效率、安全性和有效性[39,40]。

2.2 非病毒载体

非病毒载体常用的有质粒、阳离子脂质体、基因枪技术等，通常用于体外软骨细胞转染，但其转染效率低，且不能成功用于体内关节软骨基因转染[33]。本实验室采用一种新的脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle,LNP）-siRNA递送系统用于骨关节治疗的研究。LNP系统是利用阳离子脂质体包裹siRNA，通过细胞胞吞作用，将siRNA递送到软骨细胞内。研究结果表明，在体外LNP-siRNA可以转染100%软骨细胞。体内结果表明LNP可以特异性地转染关节软骨组织，并不转染滑膜。在OA大鼠模型中，关节内注射LNP-Ihh siRNA可延缓OA进展[41]。该技术不仅有可能突破在体递送siRNA至软骨细胞的瓶颈，而且还可以广泛应用于其他关节疾病的基因靶向治疗中。

3 MicroRNAs

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，由20～25个核苷酸组成。作为转录后的调节因子，与靶mRNA的3’非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）作用，可通过碱基互补配对的方式识别mRNA，但miRNAs和其潜在的目标靶之间并非完全互补，根据互补程度的不同指导RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC）降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译，在转录后水平实现对基因表达的调控[42,43]。有 30 余种 miRNAs，包括 miR-455s[44]、miR-145[45,46]、miR-27b[47]、miR-146a[48]、miR-199a[49]在人类骨关节炎样本中异常表达，表明这些miRNAs在人类骨关节炎的发生发展过程中起重要作用。

miR-140在成人关节软骨中高表达，OA时其表达降低，用IL-1β处理体外培养的软骨细胞，miR-140的表达下调。而在IL-1β作用的软骨细胞中过表达miR-140，炎症因子IL-1β、IL-6，以及软骨分解代谢因子ADAMTS4的表达下调，而合成代谢指标糖胺多糖和SOX-9的表达上调[50]。有研究采用慢病毒载体介导miR-140行关节腔注射用于大鼠实验性类风湿性关节炎的治疗，结果表明，miR-140关节腔注射后可以减轻滑膜炎症，减少新生血管形成及关节软骨破坏[51]。同样，给予大鼠膝关节OA模型关节腔注射miR-140，可以通过调节软骨基质的代谢，延缓骨关节炎的进展，对关节软骨起到保护作用[52]。

除了miR-140，其他miRNAs在骨关节炎的发生发展过程中也起到重要作用。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是骨关节炎重要的致炎因子，研究显示，miR-142-3p可以抑制高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的表达，从而抑制软骨细胞凋亡，通过关节腔注射慢病毒过表达miR-142-3p可以阻断小鼠骨关节炎的进展[53]。死亡受体6（DR6）属于肿瘤坏死因子受体超家族，可以引起细胞凋亡及激活NF-κB信号通路[54]。同样，通过大鼠关节腔注射慢病毒载体过表达miR-210，可以减少炎症因子的产生，抑制NF-κB及DR6的表达，减轻关节炎症，延缓骨关节炎病情进展[55]。

然而，并不是所有miRNAs对骨关节炎都是正性保护作用。有研究显示，miR-483-5p在人骨关节炎关节软骨及大鼠OA模型软骨中表达上调，通过慢病毒介导miR-483-5p关节腔注射上调其表达，可加重骨关节炎病理变化，而通过关节腔注射antago-miR-483-5p沉默内源性miR-483-5p的表达，骨关节炎的严重程度减轻[56]。

由于miRNAs可以同时调节多条信号通路，且在OA的发生发展的不同时期，有不同的miRNAs参与疾病的进程，因此同一种miRNA在OA中的表达，不同的研究可能会有不同的结论。例如，有研究发现，miR-146在OA关节软骨中表达上调[57]，而另一研究则得出相反的结论[58]。因此，需要进行更加深入的研究，进一步明确miRNAs在OA发生发展中的作用，为人类预防或延缓OA进程提供新的手段。

4 总结与展望

基因转染为骨关节炎的治疗提供了新的方式，已有多项小动物和大动物实验证实了其安全性和有效性，但由于病毒载体潜在的致瘤性等安全问题及非病毒载体较低的软骨转染效率，限制了其应用于临床，基因治疗应用于人体还需要更多的临床前研究。第一种骨关节炎基因治疗产品InvossaTM在韩国已被批准用于中度骨关节炎的治疗，Ⅲ期临床试验已在美国开始进行，这为骨关节炎的基因治疗提供了广阔的前景。如何使基因治疗可控，安全有效，并针对特定的细胞进行转染，需要进一步的深入研究。