绵羊miR-1基因前体序列的多态性分析

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(石河子大学 生命科学学院，新疆 石河子 832003)

MicroRNA(miRNA)是一类新型高度保守的含有21～25个核苷酸的内源性非编码RNA，它能通过与真核生物中的靶mRNA特异性相互作用，在转录后水平调节基因的表达[1-2]。miRNA已经成为新的基因调控者，其表达具有组织特异性，同时广泛存在于生物学过程中并发挥重要作用，例如细胞分化与细胞增殖[3-4]、卵母细胞成熟与卵巢卵泡发育[5-6]、代谢与细胞凋亡[7-8]、骨骼肌生长[9]。

在miRNA上存在一段识别靶位点的序列，这个序列也被称为“种子序列”[10]。如果在种子序列区域发生突变，将会影响miRNA与靶基因的识别，以致于引发一系列疾病[11]。通过对人的miR-96研究发现，在其种子序列区域发生的突变，会导致常染色体显性，从而引起渐进性听力丧失[12]。在miR-206的种子序列区域构建人工突变，会破坏它与人表皮生长因子受体hER-α-1和hER-α-2识别位点的结合[13]。

肌细胞生成是控制肌肉增殖和分化相关转录因子网络协调的复杂过程[14]。大量证据表明，miRNA可以通过增强转录控制来调控肌肉的生长和分化，在形态学中发挥重要作用[15]。通过大量研究发现，肌肉中含有一系列肌源性miRNA(Myogenic microRNA，myomiR)，包括miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-206、miR-208、miR-208b、miR-486、miR-499等[16-19]。因此，myomiR功能的改变可能会显著影响肌肉表型，所以miRNA在骨骼肌的生长和发育过程中起着十分重要的调控作用[20]。

研究表明，miR-1在绵羊骨骼肌中的表达量很高[21]，但是miR-1在不同绵羊群体中的多态性检测以及功能分析还未见报道。目前，miRNA多态性的相关研究主要集中在其与疾病发生之间的关系上，而对其他的生物学功能研究较少。因此，以绵羊miR-1基因前体序列为研究对象，采用不对称聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分别对具有不同产肉性能的引进品种(萨福克羊)和地方品种(湖羊)绵羊群体进行单核苷酸多态性(SNP)检测，并分析其与绵羊产肉量之间的相关性，为优良产肉型绵羊的选育提供依据。

1 材料和方法

1.1 样品采集与基因组提取

40份湖羊的肌肉组织采集自新疆乌鲁木齐屠宰场，39份萨福克羊的肌肉组织采集自新疆昌吉州玛纳斯县新澳畜牧有限责任公司。将采集到的肌肉样品储存在冻存管内，做好标记后放在-80 ℃冰箱中保存备用。剪取湖羊、萨福克羊的肌肉组织，使用基因组DNA提取试剂盒提取肌肉组织的基因组DNA。通过Nanodrop 1000对提取的基因组DNA进行OD(260/280)值检测。

1.2 引物设计与合成

由于绵羊miR-1基因前体的成熟序列还未公布，故从miRBase数据库查询牛miR-1基因的前体序列(登录号为MI0009719，ID为bta-miR-1)，与NCBI绵羊基因组数据库进行比对，截取前体序列及其左右侧翼各200 bp的序列，设计特异性引物，送至北京睿博兴科生物技术有限公司合成。引物序列如表1所示。

表1 绵羊miR-1基因前体PCR引物序列

1.3 PCR扩增

PCR反应体系(20 μL)：2×TaqPCR MasterMix 10 μL，上游引物与下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，DNA模板(20 ng/μL) 2 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.4 绵羊miR-1基因前体序列的不对称PCR-SSCP分析

由于传统的PCR-SSCP技术存在变性不完全的缺陷，因此，本研究采用不对称PCR-SSCP扩增的方法，即用1.3中的PCR产物为模板，利用其中1条引物与另1条引物以不同添加比例进行第2次PCR扩增，扩增出目的片段的单链(ssDNA)。第2次PCR扩增反应体系也为20 μL，其中2×TaqPCR MasterMix 10 μL，上游引物与下游引物(1条引物的浓度与第1次PCR扩增一致，与另1条引物浓度的比例为100∶1)各0.5 μL，模板(第1次PCR扩增产物)2 μL，加ddH2O至20 μL。

1.5 不对称PCR-SSCP检测

取4 μL扩增的单链DNA，与3 μL上样缓冲液进行充分混合，样品在非变性聚丙烯酰胺凝胶(10%PAGE，Acr∶Bis=39∶1)中进行电泳，电泳条件：4 ℃、120 V过夜，12～14 h左右终止电泳。凝胶处理采用银染的方法进行，具体步骤包括：固定、染色、显影、观察并拍照。根据带型的不同，选取与之相对应的PCR产物送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序分析。

1.6 单核苷酸多态性SNP位点对miR-1基因前体序列构象的影响分析

测序后获得突变基因序列及突变位点，采用RNA二级结构在线预测软件(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/index.html)对野生型和突变型的绵羊miR-1基因前体序列进行二级结构预测，并通过ΔG的变化比较2种构象的差异及稳定性。

1.7 数据处理

利用SPSS软件对SNP位点在不同产肉性能绵羊品种中的基因型频率、等位基因频率和Hardy-Weinberg平衡进行计算。

2 结果与分析

2.1 不对称PCR-SSCP分型及测序

利用设计的特异性引物对湖羊和萨福克羊2种不同产肉性能绵羊品种的基因组DNA进行PCR扩增，miR-1基因前体序列的PCR扩增片段为254 bp，与预期结果一致，达到PCR-SSCP检测的标准，可用于检测，部分PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1A所示。PCR-SSCP分析结果如图1B所示，miR-1基因前体序列在以上2种不同产肉性能绵羊品种中具有3种基因型(AA型、AG型和GG型)。

将3种基因型所对应的PCR产物进行回收纯化后测序，并通过序列比对分析，结果发现，在绵羊miR-1基因前体序列的下游115 bp处发现1个A→G的单碱基突变(图1C)。

A.部分PCR产物琼脂糖凝胶电泳，M为DL2000 DNA Marker，1—15为部分PCR产物； B.部分样品非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，AA、AG和GG分别为检测到的3种带型； C.不同基因型样品测序峰图，单峰为纯合子AA和GG，套峰为杂合子AG图1 miR-1基因前体序列PCR产物凝胶电泳与PCR-SSCP分型和测序结果

2.2 miR-1基因前体序列SNP位点的基因型频率和等位基因频率

通过PCR-SSCP分型后，对2个不同产肉性能绵羊品种的miR-1基因前体序列SNP位点进行基因型频率与等位基因频率计算，同时检测该SNP位点在各群体中是否处于Hardy-Weinberg平衡，结果如表2所示。萨福克羊是从国外引进的典型优良肉羊品种，有较高的产肉性能，其中GG基因型频率为0.74，属于优势基因型，G等位基因频率为0.76，是A等位基因频率的3.17倍。而湖羊属于我国地方品种，相比之下产肉性能差，在湖羊群体中没有检测到AA基因型。一方面可能是由于在湖羊中不存在此基因型，另一方面可能是样本量较少的缘故。遗传分析结果表明，萨福克羊在该SNP位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)，湖羊处于不平衡状态(P<0.05)。

表2 miR-1基因前体序列SNP位点基因频率与基因型频率及Hardy-Weinberg平衡状态

注：括号内为不同基因型或等位基因的个体数。

2.3 miR-1基因前体序列的同源性分析

从NCBI数据库中查询绵羊(NC 019470.2)、牛(NC 007311.6)、马(NC 009151.2)、人(NC 018931.2)、猩猩(NC 012611.1)、猪(NC 010459.5)、小鼠(NC 000068.7)的miR-1前体序列及其侧翼各200 bp序列，使用MEGA 5.0软件对miR-1基因前体序列的同源性进行分析并构建进化树，结果如图2所示，绵羊miR-1基因前体序列与偶蹄目中牛的同源性达到100%，由于小鼠在进化上较落后，因此同源性较差。

图2 miR-1基因前体序列的遗传进化树

2.4 SNP位点对 miR-1基因前体序列构象及稳定性的影响

采用RNA二级结构在线预测软件(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/index.html)对野生型和突变型绵羊的miR-1基因前体序列进行二级结构预测，结果如图3所示，当miR-1基因前体成熟序列下游115 bp 处的碱基A发生单碱基突变后，miR-1基因前体序列的二级结构发生巨大变化，由-117.7 kJ/mol降低到-119.2 kJ/mol，△G降低1.5 kJ/mol，使其二级结构更加稳定。由于该突变发生在颈环结构的颈部，这种改变很有可能会对miR-1的靶基因造成影响，并最终使其对靶基因的调控发生改变。

A.野生型绵羊的miR-1基因前体序列；B.突变型绵羊的miR-1基因前体序列图3 绵羊 miR-1基因前体序列二级结构预测

3 结论与讨论

miRNA在生物体内参与调控基因表达。近年来，对调控骨骼肌基因相关的研究已经成为一个热点，同时也受到科学家们的广泛关注。基因变异会导致miRNA介导的基因调控发生异常，进而可能会导致表型发生改变[22]。近几年的研究发现，肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)与miRNA密切相关，miRNA能够参与MSTN基因的调控，特克赛尔(Texel)绵羊的肌肉异常发达就是由于MSTN基因mRNA的3′-UTR发生突变引起，它能够与肌肉特异性miRNA相关的miR-1和miR-206创建靶点，从而下调MSTN基因的表达[23]。此外，myomiR也可通过调节多种靶基因广泛影响肌肉的发育和功能[24-26]。科学家在对果蝇和家蚕的研究中发现，miR-1也是生存相关的重要基因，含有其突变体的幼虫肌肉组织呈现萎缩状态，而且幼虫的运动逐渐减少直至死亡[27-28]。因此，miRNA基因的遗传变异可以改变miRNA的生物发生和它们与靶mRNA的结合[29-30]，如果该突变发生在种子序列区域，还将会导致靶向功能下降，并最终引起性状发生改变，继而引发一系列疾病[11-13]。

本研究确定了绵羊miR-1基因前体序列中存在1个SNP位点，它与miRNA初级转录物区域内的miRNA前体序列相连并位于其下游。同时评估了miR-1基因前体序列的该SNP位点对绵羊产肉性能的影响，发现其与绵羊的产肉性能存在明显的相关性，可能会增加绵羊的产肉量。本研究所选用的萨福克羊是从国外引进的优良肉羊品种，G等位基因频率达到0.76，是A等位基因频率的3.17倍。湖羊是我国地方品种，产肉性能方面不及萨福克羊。同时，由于湖羊群体可能受到杂交改良与选育的影响，因此在湖羊群体中野生纯合AA基因型未检测到，GG基因型向优势基因型进行过渡。由此可见，该SNP位点可能是选育优良产肉型绵羊的重要依据。与此同时，对绵羊miR-1基因前体序列突变前后的二级结构进行预测发现，该突变位点可能会对miR-1的靶基因造成影响，从而影响其调控，进一步影响到骨骼肌的生长和发育。

综上，绵羊产肉性能的高低不仅取决于基因的遗传，还取决于miRNA的表观遗传学控制。目前，miRNA的研究重点主要在医学方面，近几年，对于miRNA的研究方向也逐渐向畜牧生产方面进行过渡，本研究为优良产肉型绵羊的选育提供有力的支持。