蜡样芽胞杆菌鉴定方法研究

◎ 苏佩冰，梁梅娟，陈靖欣，殷 欢

（中山市食品药品检验所，广东 中山 528437）

蜡样芽孢杆菌属于革兰氏阳性芽孢菌，呈杆状，大小为（1.0～1.2）μm×（3.0～5.0）μm，可在菌体内形成圆形或椭圆形芽孢[1]。蜡样芽孢杆菌普遍分布在水、土壤、空气中，极易污染食品[2]。被蜡样芽孢杆菌污染的食品在室温下放置，细菌繁殖较快，达到一定量并食入后会产生肠毒素。由于该菌从外观、气味上无显著变化，食入后会引起食源性疾病即食物中毒[3]。且其在乳品、豆制品、剩米饭、肉制品、干制品（奶粉、面粉）等淀粉含量较高的食物中污染较重。因此，常被作为主要监测的食源性致病菌之一[4]。

目前，对于蜡样芽孢杆菌的鉴定方法主要有生化鉴定方法、Riboprinter核糖体分型法、VITEK2 Compact、API50 CHB检测法等。本文对这4种方法进行研究，看是否能鉴定出蜡样芽孢杆菌与其类似菌。

1 材料与方法

1.1 菌株

蜡样芽孢杆菌标准菌[CMCC（B）63303]、蕈状芽孢杆菌标准菌（ATCC 10206）、苏云金芽孢杆菌标准菌（ATCC 10792）、可疑菌。

1.2 实验的生化试剂及培养基

营养琼脂、过氧化氢溶液、酪蛋白琼脂、TSSB、琼脂硫酸锰营养琼脂、革兰氏染液、0.5%碱性复红、蜡样芽孢杆菌生化试剂盒。

1.3 鉴定方法

1.3.1 GB 4789.14-2014

生化鉴定通过革兰氏染色、过氧化氢酶、酪蛋白分解实验、生化鉴定试剂盒[动力实验、硝酸盐还原实验、溶菌酶耐性实验、V-P实验、葡萄糖利用（厌氧）实验]、根状生长实验、溶血实验、蛋白质毒素结晶实验。1.3.2 VITEK 2 Compact检测方法

VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统把细菌必须的生化反应培养基固定在卡片上，培养后通过卡片的显色读取到系统中[5]。用BCL卡将3种标准菌和可疑菌上机，14.25 h后通过电脑读取结果。

1.3.3 API50 CHB检测方法

API 50 CH是采用50个生化实验对微生物的碳水化合物的代谢进行研究。API CH与API CHB培养基配合使用，用以鉴定芽孢杆菌及相关细菌，肠杆菌科细菌和弧菌科细菌。按操作说明将目标菌制成菌悬液用API 50 CH试剂条和API 20E试剂条在30 ℃下培养24～48 h。再将结果录入API 50 CHBV4.0鉴定软件进行结果的判读。

1.3.4 RiboPrinter核糖体分型方法

RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统基于核糖体分型技术，使用常用限制性内切酶（如EcoR Ⅰ、PvuⅡ、Pst Ⅰ等）消化目标菌基因组产生的基因片段，基因片段经过电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上，与DuPont专门设计的DNA探针杂交，该探针编码与16S rRNA、23S rRNA、5S rRNA和间隔序列高度相似，杂交后通过化学发光原理产生的信号由相机捕获传至工作站产生“条形码”状条带图像（RiboPrinter 模式）基因指纹图，将基因指纹图与数据库中的标准菌株基因指纹图谱比较，达到细菌鉴定和分型的目的。检测时按照操作规程挑取纯菌落在缓冲液中加热灭活，最后上机，通过8 h在机里的操作，得到鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 GB 4789.14-2014生化鉴定的结果

GB 4789.14-2014生化鉴定的结果见表1。

表1 蜡样芽孢杆菌与类似菌生化鉴定表

革兰氏染色在油镜下观察，可疑菌、苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌从形态结构上无太大区别，蕈状芽孢杆菌呈长条状。从表1可看出，10个生化实验有8个实验结果相同，只有根状生长实验和蛋白毒素结晶实验能看到不一样。在根状生长实验中，蕈状芽孢杆菌在营养琼之平板中呈毛玻璃似的根状生长，蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和可疑菌则呈融蜡状、山谷状生长[6]。在蛋白质毒素晶体实验中，通过染色镜检观察到苏云金芽孢杆菌浅红色的游离芽孢和深红色的菱形晶体。从结果可知，仅仅依靠革兰氏染色和8个生化实验无法区分出三者，容易出现假阳性，因此只能作为辅助手段。根状生长实验可以有效鉴定蕈状芽孢杆菌，蛋白质毒素结晶实验则能有效鉴定苏云金芽孢杆菌。

2.2 VITEK 2 Compact检测的结果

VITEK 2 Compact检测的结果见表2。

表2 蜡样芽孢杆菌和类似菌VITEK 2结果表

表2结果显示，蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌和可疑菌的鉴别中，无法准确鉴别是哪种菌，需要结合蛋白毒素结晶实验、根状生长实验来鉴定蜡样芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。

2.3 API50 CHB检测的结果

试剂条的结果只有蕈状芽孢杆菌鉴定结果有90%以上，蜡样芽孢杆菌、可疑菌和苏云金芽孢杆菌无法鉴定出来。这种检测方法可以准确的鉴定出蕈状芽孢杆菌，但对于蜡样芽孢杆菌的鉴定没有太大帮助。

2.4 Riboprinter核糖体分型的结果

Riboprinter核糖体分型的结果见表3。

表3 蜡样芽孢杆菌与类似菌Riboprinter核糖体分型表

目标菌经EcoRⅠ酶切与DNA探针杂交产生了清晰的指纹图谱。从结果可知，Riboprinter核糖体分型方法可以鉴定出这4种菌，可疑菌的图谱显示该菌种是蜡样芽孢杆菌可能性达到0.92。但由于实验的数据较少，还需要通过生化实验做进一步确认。

3 分析与讨论

从4种方法的实验结果可发现，蕈状芽孢杆菌是比较容易鉴定的，可以通过形态，根状生长实验API 50 CHB将蕈状芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、可疑菌区分开。但是蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌由于DNA结构相似，只有个别碱基对有差异[7]，在这4种方法中，并没有任何一种可以简单、高效的鉴定出两者。一般都需要结合蛋白质毒素结晶实验。API 50 CHB、VITEK 2 Compact、RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统基于核糖体分型技术检测方法只能作为鉴定方法的辅助工具，最终还是需要结合根状实验和蛋白质毒素结晶实验来完成确认。RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统基于核糖体分型技术检测方法结合蛋白质毒素结晶实验可高效快速的鉴定出蜡样芽孢杆菌。

4 结论

在蜡样芽孢杆菌的鉴定中，通过RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统基于核糖体分型技术检测方法结合蛋白质毒素结晶实验，以形态观察和生化实验为辅助手段，可提高蜡样芽孢杆菌鉴定的准确性，降低假阳性、假阴性出现的概率，解决蜡样芽孢杆菌难鉴定的问题。