屎肠球菌制剂对泌乳中期奶牛血清生化、抗氧化和免疫指标的影响

■徐巧云 王梦芝* 霍永久 罗昱宏

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009；2.滨海普润生物科技有限公司，江苏盐城224500）

随着国民经济和人们生活水平的不断提高，人们对牛奶的需求数量以及牛奶的品质要求也不断提升。影响牛奶质量的因素很多，而预防奶牛疾病，提高免疫力，降低病原微生物的侵袭是培育健康奶牛的重点工作[1]。近年来，微生态制剂已成为公认的理想抗生素替代品，其能有效地增加有益菌的数量，抑制病原微生物菌群的定植，从而改善肠道微生态平衡，提高机体免疫力[2]。尤升波等[3]添加乳酸菌、酵母菌等复合微生态制剂，在一定程度上增强奶牛抗热应激能力，改善其泌乳性能，减缓奶牛夏季高温条件下奶产量下滑的情况。屎肠球菌作为肠道常见的益生菌不仅可以通过生物拮抗、生物夺氧、增加有益菌数量，增强机体免疫机能，并且具有提高饲料转化率,改善生产性能,提高动物产品品质等作用[4]。研究表明，6周龄雌性小鼠口服屎肠球菌可以显著增加小鼠血浆中IgG浓度，白细胞介素4（IL-4），白细胞介素-6（IL-6）和干扰素-γ（IFN-γ）水平[5]。Pollmann等[6]研究屎肠球菌对猪自然衣原体感染率时发现，给饲喂添加有屎肠球菌的日粮后，断奶仔猪肠道内定植的致病菌有所下降,并且仔猪腹泻情况也有所缓解。朱芬花等[7]研究表明，在平均日采食量、平均日产奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、IgG含量、IgA含量、IgM含量中，III组（精饲料与粗饲料比60∶40）显著高于I组（精饲料与粗饲料比40∶60）。

屎肠球菌在培养过程中能产生大量的乳酸,属乳酸菌[8]。在复合乳酸菌对奶牛泌乳性能、血液免疫和抗氧化指标的影响的研究中，刘华伟等[9]发现饲喂30 g/d乳酸菌制剂与对照组相比，显著提高了奶牛的产奶量，并且奶牛血清中免疫球蛋白G(IgG)和可溶性CD4(SCD4)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)的活性均显著升高。综上所述，提高产奶量，改善乳品质与动物本身的健康存在一定的联系。为此，本试验以屎肠球菌为研究对象，在奶牛饲粮中添加不同量的屎肠球菌的方式来观察其血清生化、抗氧化、免疫指标的变化，以期为探讨益生菌与促进牛奶品质的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

试验随机分为3组：对照组（基础日粮）、低剂量组[基础日粮+30 g/(d·头)屎肠球菌]、高剂量组[基础日粮+60 g/(d·头)屎肠球菌]，每组8个重复。选择24头体重、胎次（1～2胎）、泌乳期（40±2）d、泌乳量（21.0±1.0）kg、体况（3.0分）等性状相对一致的荷斯坦奶牛作为试验动物。试验期为42 d，包括预试期14 d，正试期28 d。根据扬州大学实验农牧场提供并参照NRC（2001）[10]奶牛饲养标准配制试验基础日粮，日粮采用TMR混合机混合（基础日粮组成及营养水平见表1）。保证试验奶牛均固定槽位，适当运动，自由饮水，饲养管理皆保持一致。本试验屎肠球菌由滨海普润生物科技有限公司提供，为粉状，白色，使用石灰粉搅拌稀释，细菌数含量为1.0×1010CFU/g。同舍分单圈饲养试验牛，每天早晚适量饲喂2次（添加剂先与部分日粮先混合，再混合），分早、中、晚3次挤奶。

1.2 样品采集

分别在正试期第0、14、28 d晨饲前采集尾静脉血样，部分加入EDTA·Na2抗凝管中，用于血常规分析，部分加入促凝管中，3 000 r/min离心5 min获取血清，用于免疫球蛋白等生化指标测定。

1.3 血清免疫球蛋白IgA、IgG及IgE测定

购买北京华英生物技术研究所的牛IgA、IgG、IgE检测试剂盒，进行测定血清中IgA、IgG及IgE，具体测定步骤参照试剂盒说明书进行。

表1 基础日粮组成及营养水平（干物质基础）

1.4 血清免疫细胞因子IL-1、IL-6及TNF-α测定

均采用放射免疫法测定，所使用的IL-1、IL-6、ALCAM及TNF-α检测ELISA试剂盒均购自上海R&B公司，具体测定步骤参照试剂盒说明书进行。

1.5 血常规及血液生化指标测定

血清样品送至扬州市疾病控制中心测定总蛋白、白球比、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇浓度及谷草转氨酶等指标。

1.6 血清抗氧化等指标测定

还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和丙二醛的测定分别采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒。

1.7 统计分析

所获得的数据资料采用Excel对试验数据进行整理，采用SPSS 18.0软件进行方差分析和邓肯氏多重比较。P值小于0.05为显著差异水平。

2 结果与分析

2.1 屎肠球菌对荷斯坦奶牛血常规和血液生化指标的影响（见表2、表3）

由表2可知，添加屎肠球菌在白细胞、血红蛋白、血小板、红细胞压积、红细胞平均体积、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、红细胞分布标准差上无明显差异（P＞0.05）；红细胞低剂量组显著高于高剂量组（P＜0.05），与对照组相比差异不显著（P＞0.05）；时间上，除红细胞分布宽度在第28 d显著低于第0、14 d（P＜0.05），其他指标均无显著差异（P＞0.05）。

由表3可知，白蛋白、碱性磷酸酶、总胆固醇、总蛋白、血中尿素氮、甘油三酯在处理组和时间轴上无显著差异（P＞0.05）；高剂量组乳酸脱氢酶显著低于对照组（P＜0.05），与低剂量组相比差异不明显（P＞0.05），时间轴上，白蛋白含量差异不显著（P＞0.05）；低剂量组在谷丙转氨酶和血糖中与对照组相比无明显差异（P＞0.05），但显著高于高剂量组（P＜0.05），谷丙转氨酶在时间轴上无显著差异（P＞0.05），但血糖在时间上差异显著（P＜0.05），并随着时间变化逐步增高；谷草转氨酶在低剂量组显著高于对照组（P＜0.05），与高剂量组相比差异不显著（P＞0.05）；高密度脂蛋白含量在第28 d显著低于第0、14 d，但处理组间差异不明显（P＞0.05）；对照组低密度脂蛋白与高剂量组无显著差异（P＞0.05），但高于低剂量组（P＜0.05），时间上，第28 d与第14 d差异不显著（P＞0.05），显著高于第0 d（P＜0.05）。

2.2 对奶牛血清抗氧化和免疫指标的影响(见表4)

由表4可知，丙二醛、还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶组间无显著差异（P＞0.05），丙二醛浓度和还原型谷胱甘肽浓度在第28 d均显著高于第14 d（P＜0.05），第14 d的超氧化物歧化酶活力与其他两个时间点差异不显著（P＞0.05），但第0 d显著低于第28 d（P＜0.05），过氧化氢酶的活力在第0 d显著高于第14、28 d（P＜0.05）；IgG、IgA组间差异不明显（P＞0.05），IgA时间上第14 d含量最高，第0 d其次，第28 d最低，第28 d的IgG含量显著低于第0、14 d（P＜0.05）；高剂量组肿瘤坏死因子显著低于对照组和低剂量组，肿瘤坏死因子在第28 d的含量显著低于第0、14 d（P＜0.05）；白细胞介素1、白细胞介素6在处理和时间上无显著差异（P＞0.05）；细胞黏附因子处理组间无明显差异（P＞0.05），但第28 d的含量显著低于第0、14 d（P＜0.05）。

表2 屎肠球菌对血常规的影响

3 讨论

3.1 屎肠球菌对荷斯坦奶牛血常规和血液生化指标的影响

屎肠球菌是新培育出的乳酸菌类微生态制剂，属于益生菌的一种，其能通过分泌有机酸和细菌素等物质抑制有害菌的生长，与致病菌竞争，调整肠道菌群平衡，提高动物健康水平[11]。血液作为动物机体内环境重要的组成部分之一，动物机体的健康和代谢状况可根据其生理生化指标的改变进行评估[12]。正常生理状况下，血液中红细胞的数量是处于稳定状态，其数量也可以根据红细胞压积来反应。红细胞具有吞噬、免疫、防御感染等作用，并且红细胞的数量决定了血红蛋白的数量，而血红蛋白使红细胞具有运输氧的功能[13]。研究证明，血液中红细胞表面所具有的红细胞C3b受体花环(C3bRR)能使组织免遭循环免疫复合物沉积所致的损伤，黏附、清除免疫复合物,并且红细胞也参与机体免疫功能[14]。饶家荣[15]通过对昆明荷斯坦奶牛红细胞(RBC)C3bRR和免疫复合物花环(ICR)的检测发现健康奶牛红细胞膜上也具有C3b受体。另外，红细胞膜上的多种免疫物质及其细胞因子能够促进淋巴细胞的增殖和分化，并参与T淋巴细胞、NK细胞、吞噬细胞等的免疫功能调节[16]。文静等[17]在屎肠球菌对仔猪生长性能、免疫和抗氧化功能的影响的研究中发现饲喂添加屎肠球菌(菌含量为1×106CFU/g饲料)，提高了仔猪血清中C3、C4补体水平，分别为25.00%和76.08%。

表3 屎肠球菌对血清生化指标的影响

王永等[11]研究表明，饲粮中添加300 mg/kg的屎肠球菌相对于抗生素组显著提高了血液中的红细胞总数和血红蛋白含量。本试验中，低剂量组的红细胞数量显著高于高剂量组，且血红蛋白和红细胞压积中低剂量组数值上高于其他两组，说明屎肠球菌可能通过促进血红蛋白含量从而促进奶牛的免疫力。

表4 屎肠球菌对血液抗氧化和免疫指标的影响

血糖的相对恒定对维持机体的正常生理功能有重要意义，其主要来源于小肠内糖类的消化吸收和肝糖原的分解[18]。血糖浓度值过高或过低均不利于动物的正常生理代谢[19]。血糖浓度的升高刺激机体释放胰岛素，从而促进糖原、蛋白质合成及脂肪的沉积，有利于机体的合成代谢；低血糖浓度的降低促进胰高血糖的产生从而促进糖异生和糖原分解[20]。林谦等[21]在益生菌与酶制剂对黄羽肉鸡血液生化指标和免疫性能影响的协同效应研究中发现各组血清葡萄糖含量差异不显著，但是益生菌与酶制剂组合添加组的血糖浓度相对较高，这说明了益生菌与酶制剂两者组合促进肠道吸收入血液的葡萄糖量，有提高机体能量代谢水平的趋势。有研究表明，饲粮中添加屎肠球菌混合添加剂或者单独添加屎肠球菌，都能提高围产奶牛泌乳量和血液中葡萄糖和胰岛素的水平，降低游离脂肪酸水平[22]。本试验低剂量组血糖浓度与参考值(3.2±0.38)mmol/l接近，对照组和高剂量组相对较低，这说明屎肠球菌低剂量组有促进血糖稳定的作用[23]。

机体内大部分转运的脂肪酸被肝脏吸收后可通过酯化与磷脂、载体脂蛋白等结合形成脂蛋白，这里主要是极低密度脂蛋白。极低密度脂蛋白在转运过程中，失去甘油三酯，从而形成低密度脂蛋白，而低密度脂蛋白会进一步形成高密度脂蛋白[24]。饲粮中添加益生菌有助于奶牛瘤胃菌群活力的激活，有益菌数量的增加及饲料中纤维分解速度的加快，从而促进挥发性脂肪酸的合成,最终有利于提高泌乳量[25]。本试验中，低密度脂蛋白在低剂量组显著低于其他两组，而第0 d三组低密度脂蛋白含量差异本身较大，这可能是屎肠球菌促进乳腺吸收血液中C16∶0等与极低密度蛋白结合的脂肪酸或者极高密度蛋白与多不饱和脂肪酸结合的形式[26]。乳酸脱氢酶主要存在于肝脏、心肌、肾脏等重要部位，是动物体反应能量代谢重要指标之一，其主要功能是在糖代谢过程中催化丙酮酸产生乳酸[27]。有研究证明，当动物体有少量组织坏死时，组织中的乳酸脱氢酶会释放进入血液中，从而使其浓度增加[28]。另外，乳酸脱氢酶含量的高低也反映了奶牛的应激状态[18]。谷丙转氨酶主要存在于肝脏中，谷草转氨酶含量最多的组织是心脏和骨骼肌，其次是肝脏、肝脏细胞或某些损伤或坏死组织中[27]。谷丙转氨酶正常值在14～38 U/l，谷草转氨酶在78～132 U/l[29]。江科等[30]研究表明，每天饲喂乳酸菌，奶牛乳脂率、乳

蛋白率和乳糖含量与对照组相比差异不显著，但泌乳量增加了1.59 kg/(头·d)。本试验中，低剂量组乳酸脱氢酶含量在其他两组之间，说明低剂量组奶牛处于相对安静、平稳状态。低剂量组的谷丙转氨酶和谷草转氨酶浓度均在正常值范围以内，但低剂量组数值上均高于其他两组，这可能是由于奶牛泌乳量的提高，对肝脏发生了一定程度的损害，从而使谷丙转氨酶和谷草转氨酶浓度有所升高；谷草转氨酶在对照组中浓度低于参考值，但随着时间渐渐升高，可能是接近分娩造成的差异[20]。

3.2 屎肠球菌对奶牛血清抗氧化和免疫指标的影响

氧化应激指机体遭受各种有害刺激时，体内产生过多的高活性分子，例如活性氮自由基和活性氧自由基，过多氧自由基的积累会破坏抗氧化和氧化之间的平衡，导致机体生物大分子受损从而影响细胞的生物学功能，最终导致细胞凋亡[31]。研究证明，添加微生物制剂能有效地提高血清中超氧化物歧化酶的含量，而超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽、丙二醛等抗氧化酶可以有效地预防氧自由基的堆积[32]。丙二醛是油脂氧化酸败重要的有毒有害物质之一，其可能通过细胞膜脂质过氧化，促使细胞膜结构完整性受到损伤作用，导致细胞凋亡[33]。王永等[11]在饲粮中添加500 mg/kg的屎肠球菌研究表明，添加屎肠球菌可以降低血清中丙二醛水平，增强机体抗氧化能力。本试验中丙二醛含量随时间显著增加，这可能是本试验处于夏季，动物应激较大，但低剂量组丙二醛含量在数值上低于其他两组。据文静等[17]报道，屎肠球菌能提高仔猪免疫力，与对照组相比，仔猪血清中IgA、IgG和谷胱甘肽分别提高了16.48%、25.43%、46.80%，但总超氧化物歧化酶活力降低了10.38%。夏锴等[8]在屎肠球菌饲用效果及作用机理中表明，添加屎肠球菌可以显著提高仔猪胰脏中过氧化氢酶活性，降低丙二醛含量。肖丽霞等[34]给急性酒精性肝损伤小鼠饲喂屎肠球菌发现，小鼠体内超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽含量显著升高，但丙二醛含量显著降低。

屎肠球菌在肠道内迅速定植，消耗掉肠内的氧气和过氧化氢，降低了肠道内氧化还原电位，形成良好的厌氧环境，且有研究证明，日粮中添加屎肠球菌可以显著提高过氧化氢酶的活性[8]。M.Fukata等[35]研究表明，给小鼠饲喂选择性乳酸杆菌可以抑制炎性细胞因子IL-1β、γ干扰素、肿瘤坏死因子-α信使RNA的表达。另外也有报道认为嗜酸性乳酸杆菌等可刺激人类或小鼠树突状细胞，树突状细胞开始成熟，细胞表面开始呈现能够捕获抗原的主要组织相容性复合体(MHC)，然后在MHC刺激下机体开始合成肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-β(IL-β)和白细胞介素-12(IL-12)等炎症相关细胞因子[36]。Konstantinov等[37]报道，鼠李糖乳酸杆菌GG可减少肿瘤坏死因子对结肠上皮的损伤,促进结肠上皮细胞生长。乳酸菌可以根据菌量的变化来调节IL-10、IL-1β、IFN-γ、TNF-α的含量[36]。本试验在丙二醛、还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶组中IgG、IgA、细胞黏附因子等无显著影响，其中过氧化氢酶、IgG、IgA、肿瘤坏死因子、细胞激活黏附因子在时间轴上显著降低，这可能是处于夏季，动物应激较大，免疫力下降，机体内自由基过多，抗氧化反应激烈。但高剂量屎肠球菌组在肿瘤坏死因子中显著低于对照组和低剂量屎肠球菌组，这表明在日粮中添加屎肠球菌在一定程度上能够提高机体抗氧化和增强机体对疾病的抵抗能力。

4 结论

综上表明，饲粮中低剂量的添加屎肠球菌，提高了红细胞数量和抗肿瘤因子的浓度，降低了乳酸脱氢酶的浓度，有利于机体免疫力的提高。