龙须菜四分孢子体不同发育阶段差异表达基因克隆和启动子区分析与刺激响应研究❋

李晓东， 隋正红， 彭 冲， 王津果， 刘昊昕

(中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东 青岛 266003)

龙须菜(Gracilariopsislemaneiformis)隶属于江蓠科(Gracilariaceae)[1-2]，是我国重要的经济海藻和生产琼胶的重要原料[3]。龙须菜的生活史可以在实验室条件下完成，具备进行遗传学研究的基本条件[4]。

龙须菜的生活史属于真红藻纲典型的三世代型生活史，由2个二倍体的孢子体世代(四分孢子体、附生生长果孢子)和1个单倍体的配子体世代组成[5]。在整个生活史过程中，四分孢子是由二倍体的四分孢子体经过减数分裂形成并放散的，放散到体外后会选择合适的基质附着进而发育形成单倍的雌雄配子体。四分孢子体是龙须菜二倍体形成单倍体的一个中间重要环节，也是龙须菜栽培产业中的主要材料。

育性在龙须菜中主要体现为二倍体(四分孢子体)产生四分孢子和单倍体(配子体)产生果孢(雌配子)与精子(雄配子)的能力。龙须菜配子体中，囊果数或其分布密度是作为判断配子体育性高低的指标，而四分孢子体四分孢子囊数量和四分孢子放散量可以作为孢子体育性高低的指标[6]。

目前常用的栽培品种“981”四分孢子放散量极低，与“鲁龙1号”四分孢子体的放散量相差1～2个数量级[6]，即 “981”具有低育性。对于藻类而言，低育意味着形成或者放散的生殖细胞数量较少，从而对藻体造成的损伤面积相对较小，张祐基等强调较小的成熟面积是优良品系的一个突出性状[7]。对四分孢子体发育过程进行研究，有助于深入了解种群是如何维持和繁殖的，揭示藻类生殖发育过程中的遗传调控机制，进而获得与育性相关的重要基因和信息，在藻类遗传育种、获得优良品种方面具有重要应用价值。

龙须菜四分孢子体的发育过程分为4个阶段——未成熟期(Ⅰ阶段)、成熟期(Ⅱ阶段)、放散期(Ⅲ阶段)、成熟后期(Ⅳ阶段)。王津果对“981”和“鲁龙1号”四分孢子体不同发育阶段的样品进行了数字表达谱(Digital Gene Expression，DGE)分析，揭示了2个品种在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ阶段基因表达水平的变化[6]。“981”II阶段形成四分孢子囊数量显著少于“鲁龙1号”，且畸形率高，这些特点均与其低育特性吻合。本研究通过检索“981”II阶段相对I阶段的高差异表达基因，并结合“981”和“鲁龙1号”在II阶段差异基因的表达情况进行分析，选择D-乳酸脱氢酶(D-lactate dehydrogenase，dld)，谷氨酰胺合成酶(glutamine，gln2)和热激蛋白(hot shock protein，hsp15.4)作为研究基因。

D-乳酸脱氢酶是一种以NAD+为氢受体，作用于D-乳酸，用于催化乳酸和丙酮酸相互转化的酶。在乳酸菌有氧培养中，没有或极少量的葡萄糖浓度条件下(<0.5%)，dld的活性降低，大量孢子产生；加入大量葡萄糖后(浓度>20%)，dld的活性增加，抑制孢子形成，说明dld可能与乳酸菌生殖细胞形成时期的调控有关[8]。

在高等植物中，谷氨酰胺合成酶是氮素代谢途径中的关键酶之一，它可以联合谷氨酸合成酶催化谷氨酸转化为谷氨酰胺[9]。谷氨酰胺合成酶在盘基网柄菌孢子母细胞中的活性比在柄细胞中的活性高约4倍，为谷氨酰胺合成酶调节盘基网柄菌发育提供了证据[10]。谷氨酰胺合成酶在水稻花粉成熟过程中起到重要作用，谷氨酰胺合成酶基因表达量低的植株虽然可以完成整个生育期，但受精形成的种子数量少于正常植株[11]。

热激蛋白是一类广泛分布于各类生物细胞内且高度保守的蛋白分子，在高温、干旱、过氧化、重金属等逆境下均能大量表达[12]，主要通过参与蛋白合成、折叠、细胞定位及蛋白降解等多种生物功能来维持植物内环境的稳定[13]，在植物抵御逆境及适应环境中发挥重要作用，参与细胞各项正常生理活动[14-15]。在对小麦发育关键时期的研究中发现，诱导热激蛋白hsp23.5基因的表达，可增大花粉的育性[16]。

启动子区是位于DNA上基因转录起始位点前1 500～2 000 bp的一段序列，在启动子区存在许多重要的转录调控元件，这些调控元件响应不同的信号刺激，从而针对不同的刺激控制下游基因的表达。研究基因启动子元件对于解析基因表达调控具有重要意义。

本研究克隆得到了龙须菜dld基因完整的ORF及上游启动子区序列，对ORF编译的氨基酸序列进行了信号肽、跨膜区、蛋白结构域的分析，并进行同源性比对。结合gln2、hsp15.4启动子区序列，预测得到了基因调控的顺式作用元件。根据启动子区预测结果设置龙须菜诱导培养条件，通过半定量PCR分析在诱导条件下基因表达量变化，探究3个基因的表达调控机理。

1 材料方法

1.1 实验材料

龙须菜“鲁龙1号”的四分孢子体样品采集于青岛胶州湾养殖海区(36°08′N, 120°17′E)。将表面的附生生物、泥沙等肉眼可见的污染物冲洗干净后，挑选生长状态良好的藻株置于洁净灭菌的1 L广口锥形瓶中，加入含有Pro培养基的灭菌海水，置于22 ℃、盐度30、光照50 μmol·m-2·s-1、光暗周期12 h∶12 h的条件下驯养1周，中间更换1次海水，加入新的培养基。

驯化培养结束后，按照如下培养条件进行诱导培养。培养均置于250 mL的锥形瓶中，每个锥形瓶中加入4株生长状况良好的龙须菜。

光照强度诱导：分为高光照强度(50 μmol·m-2·s-1)，正常光照(30 μmol·m-2·s-1)，无光照强度(0 μmol·m-2·s-1)，培养时间为1、3 d。其他培养条件为：温度20 ℃，盐度33，光暗周期12 h∶12 h。

茉莉酸甲酯处理：茉莉酸甲酯浓度为0、100、200、500 μmol/L，处理时间为0、30、60 min。其他培养条件为：光照强度30 μmol·m-2·s-1，温度20 ℃，盐度33，光暗周期12 h∶12 h。

材料处理后，每个处理组取3株生长状况一致的龙须菜切尖，液氮中速冻后置于-80 ℃保存。

1.2 基因组DNA的提取及cDNA的制备

利用植物基因组DNA提取试剂盒(天根)提取龙须菜样品基因组DNA。利用植物RNA提取试剂盒(OMEGA)提取龙须菜样品总RNA，并利用核酸蛋白质检测仪检测提取RNA的浓度以及OD260/OD280，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。利用RNA反转录试剂盒(Takara)，将提取的RNA反转录成cDNA，置于-20 ℃条件下保存。

1.3 不同阶段差异表达基因的分析及克隆

将“981” I阶段的表达谱数据与其II阶段的数据[6]进行对比分析，筛选得到差异表达10倍以上的(|log2Fold Change |> 3.333 3)基因；筛选“981”与“鲁龙1号”在II阶段的差异表达基因(padj < 0.05)[6]；将上述得到的2组差异表达基因取交集，这些基因即为可能参与龙须菜生殖细胞形成时期(II阶段)调控的育性相关基因，且与“981”低育特性存在联系。通过本地BLAST将上述基因注释到Swiss-Prot数据库，从功能已知的基因中检索，选择有文献报道的功能与育性相关的基因——dld、gln2、hsp15.4作为本研究的目的基因。

将3个基因的序列与龙须菜全基因组Survey数据[19]进行比对，得到基因的上下游序列，使用Primer Premier 5.0软件设计dld基因的全长扩增引物(-all)和3个基因半定量引物(-q)，选择18SrRNA基因[20]作为半定量PCR的内参基因(见表1)。

表1 本研究所用引物序列Table 1 The sequence of primers used in this study

PCR反应体系中含有10×PCR Buffer 2 μL，25 mmol/ L的MgCl21.2 μL，2.5 mmol/ L的dNTP 1.5 μL，10 μmol/ L的正反向引物各1 μL，1 μL的Taq DNA聚合酶和20 ng全基因组DNA模板。反应条件为：94 ℃预变性5 min，1个循环；94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s(在全基因克隆的扩增反应中设为45 s)，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

dld全基因扩增产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)进行目的条带回收。参照PMD18-T说明书，将回收的目的条带与PMD18-T载体连接，转化到感受态大肠杆菌DH5α菌株中，PCR检测显示阳性克隆的单菌落接种于LB培养基中培养6 h。菌液送上海生工生物公司进行双向测序。

1.4 序列的生物信息学分析

用BioEdit v7.0软件检查双向测序的结果，删除序列两端背景杂乱碱基，并利用MEGA6.0软件拼接得到基因全长序列和上游序列，分别与龙须菜转录组和全基因组Survey数据中基因所在的Scaffold片段进行比对，确定目的基因的存在及其序列信息。利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)推测开放阅读框，结合MEGA6.0软件进行氨基酸序列翻译。蛋白质的分子量与等电点使用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)进行预测；利用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白信号肽；跨膜区通过TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)进行分析；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白质功能结构域分析；将获得的dld氨基酸序列在NCBI上通过BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab)进行同源性比对分析，下载同源性最高的15个物种的氨基酸序列，使用Clustal X软件进行多重比对分析，通过MEGA 6.0软件构建NJ系统进化树，用Bootstrap法对进化树进行评估，Bootstrap设置为1 000次重复。利用PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对获得的dld、gln2、hsp15.4基因的上游序列的启动子元件进行分析，每个基因的预测区域为转录起始位点上游的1 500 bp序列。

1.5 半定量PCR循环数的确定

首先按照以下组分配置半定量PCR反应液：不同处理下cDNA模板1 μL，10× PCR缓冲液2 μL，Mg2+溶液(25 mm) 2 μL，dNTP Mix溶液(2 mm) 2 μL，各基因半定量正向引物(10 μmol/L)1 μL，各基因半定量反向引物(10 μmol/L)1 μL，Taq聚合酶0.1 μL，加ddH2O至20 μL。设置PCR循环数梯度为15～28个循环，半定量PCR反应按照如下程序进行：94 ℃预变性8 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，延伸30 s，进行15～28个循环；延伸10 min。半定量PCR结束后，对每个处理的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条带使用Gelpro32软件进行分析。

1.6 不同处理样品表达量的检测

通过上一步实验确定半定量PCR的循环数，以诱导培养材料的cDNA为模板，其余PCR反应体系和程序与上一步相同，每个处理的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条带使用Gelpro32软件进行分析，并用SPSS 22软件处理数据。采用单因素方差分析对数据结果进行差异显著性检验，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 dld基因的克隆及氨基酸序列分析

克隆得到dld基因ORF序列全长1 674 bp，编码557个氨基酸，分子量为59 900.55，理论等电点为6.58。带负电的氨基酸残基(Asp、Glu)为63个，带正电的氨基酸残基(Arg、Lys)为60个，不存在信号肽，存在2个跨膜区，分别为TM1(位置56～78 aa，长度23 aa，方向为膜内向膜外)，TM2(228～248 aa，长度21 aa，方向为膜外向膜内)。蛋白功能结构预测发现在2～71 aa的位置，存在一段长70 aa的低复杂性区域(Low complexityregion，LCR)。D-乳酸脱氢酶结构域在312～553 aa处。龙须菜dld基因编码氨基酸序列与同属红藻门的脐形紫菜Porphyraumbilicalis序列结构相近，而与双子叶植物差异较多(见图1)。

(实线框表示预测跨膜区，双箭头实线表示预测LCR区，实线表示预测的dld结构域；相同氨基酸用“*”表示，相似氨基酸用“·”与“：”表示。The box, transmembrane region; Double-headed arrow, low complexityregion; Solid line,dldprotein domains; “*”, same amino acids; “·” and “:”, similar amino acids.)

图1dld基因编码氨基酸序列比对结果
Fig.1 The amino acid sequences alignment ofdld

2.2 氨基酸序列进化分析

基于dld基因编码的氨基酸序列所构建的NJ树拓扑结构主要分为2个类群(见图2)，其中龙须菜与脐形紫菜聚为一支，二者均属于红藻门，其他双子叶植物聚为另一大支。

2.3 dld、gln2、hsp15.4基因上游序列的启动子元件分析

克隆得到dld基因上游序列1 500 bp，结合hsp15.4和gln2基因上游序列[21]进行启动子区分析。预测各基因启动子区作用元件20种(见表2)，分为光照、激素和其它3大类。其中光照刺激响应原件最多，dld基因有11处，gln2基因有6处，hsp15.4基因有11处。根据元件预测结果，并且考虑到实验操作性与可行性，本研究对光照响应(Light responsiveness)和茉莉酸甲酯响应(MeJA-responsiveness)设置诱导条件进行验证。

图2 基于dld基因编码氨基酸序列的NJ进化树Fig.2 NJ tree based on amino acid sequence of dld2.3 dld、gln2、hsp15.4基因上游序列的启动子元件分析

功能Function dldgln2hsp15.4光照相关Light光照响应元件Light responsive element11611部分光照响应元件Part of a light responsive element373光照响应顺式作用元件Cis-acting element involved in light responsiveness121光照响应顺式作用调控元件Cis-acting regulatory element involved in light responsiveness565光照响应相关保守DNA区域Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness020激素相关Hormone茉莉酸甲酯响应顺式作用元件Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness464脱落酸响应顺式作用元件Cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness222脱落酸与VP1响应顺式作用元件Cis-acting element involved in ABA and VP1 responsiveness010赤霉素响应元件Gibberellin-responsive element101其它OthersMYBHv1 结合位点 MYBHv1 binding site323真菌诱导因子响应元件Fungal elicitor responsive element010缺氧应答增强子元件Enhancer-like element involved in anoxic specific inducibility212

续表2

功能Function dldgln2hsp15.4核心启动子元件Core promoter element around -30 of transcription start313常见的顺式作用元件Common cis-acting element in promoter and enhancer regions141414胚乳表达顺式作用元件Cis-regulatory element involved in endosperm expression121其它Others胚乳表达必要的顺式作用元件Cis-acting regulatory element required for endosperm expression333分生组织激活顺式作用元件Cis-acting regulatory element related to meristem specific activation110细胞循环管理顺式作用元件Cis-acting element involved in cell cycle regulation101低温应答顺式作用元件Cis-acting element involved in low-temperature responsiveness010

2.4 半定量PCR确定基因的表达量变化

2.4.1 半定量PCR循环数的确定及内参基因的扩增 对设置的PCR循环数梯度(15～28个循环)的PCR产物进行电泳检验。图3表示循环数为20～25的PCR产物电泳结果。结果显示，当PCR循环数为23时，开始出现目的条带。循环数为24时，目的条带亮度增加，说明循环数24时，PCR扩增产物仍处于指数增长阶段，因此本研究选择以24作为半定量PCR确定基因表达量的循环数(见图3)。

(1～6代表循环数为20～25，M为marker DL2000。No.1～No.6.The cycle number 20-25; M.DL2000.)

图3 确定半定量PCR循环数
Fig.3 The cycle number determination of semi-quantitative PCR

本研究采用龙须菜实验中常用的18SrRNA基因作为内参基因，对18SrRNA基因在不同诱导条件龙须菜中的表达情况进行分析，图4表示18SrRNA的表达结果稳定。

(M．DL2000; 1．无光培养1 d；2．正常光培养1 d；3．强光培养1 d；4．无光培养3 d；5．正常光培养3 d；,6．强光培养3 d；7、8．驯化后无处理；9．100 μmol/L MeJA培养30 min；10．200 μmol/L MeJA培养30 min；11．500 μmol/L MeJA培养30 min；12．100 μmol/L MeJA培养1 h；13．200 μmol/L MeJA培养1 h；14，500 μmol/L MeJA培养1 h。M: d2000; 1．One cultivation day without illumination; 2．One cultivation day with normal illumination intensity; 3．One cultivation day with high illumination intensity; 4．Three cultivation days without illumination; 5．three cultivation days with normal illumination intensity; 6．Three cultivation days with high illumination intensity; 7,8．Normal group (no treatment after one week cultivation within lab) ; 9．30 minutes under 100 μmol/L MeJA condition; 10．30 minutes under 200 μmol/L MeJA condition; 11．30 minutes under 500 μmol/L MeJA condition; 12．1 hour under 100 μmol/L MeJA condition; 13．1 hour under 200μmol/L MeJA condition; 14．1 hour under 500 μmol/L MeJA condition.)

图4 内参基因18SrRNA扩增结果
Fig.4 The amplification result of 18SrRNAreference gene

2.4.2 光照处理下基因的表达量变化 图5所示为不同光照强度下诱导3 d时间，龙须菜育性相关基因dld、gln2、hsp15.4的半定量PCR电泳图。无光照条件下，所有基因的电泳条带亮度均很弱，说明基因表达量均较低；正常光照与高光照条件下，基因的电泳条带亮度均高于无光照条件下电泳条带亮度，说明光照强度刺激可以促进dld、gln2、hsp15.4基因的表达。

相同光照和相同处理时间下，hsp15.4的表达量最高，gln2的表达量最低。

处理1和3 d时间，dld、gln2、hsp15.4基因在高光照强度下的表达量均高于正常光照下的表达量，无光处理3 d的基因表达量要低于无光处理1 d的基因表达量。随着光照强度的增加，3个基因的表达量均增加。

无光和强光条件下，处理1和3 d，3个基因的表达量差异不显著；正常光照下，处理1和3 d，3个基因的表达量差异显著(见图6)。

2.4.3 茉莉酸甲酯处理下基因的表达量变化 图7所示为不同茉莉酸甲酯诱导条件下，龙须菜育性相关基因dld、gln2、hsp15.4的半定量PCR电泳图。低茉莉酸甲酯浓度下，所有基因的电泳条带亮度均很弱，说明基因表达量均较低；随着茉莉酸甲酯浓度升高以及诱导时间增加，基因的电泳条带亮度增加，说明茉莉酸甲酯刺激可以促进dld、gln2、hsp15.4基因的表达。

相同茉莉酸甲酯浓度和相同诱导时间下，hsp15.4的表达量最高，gln2的表达量最低。

茉莉酸甲酯诱导30 min和1 h，随着浓度升高(0、100、200和500 μmol/L)，dld、gln2、hsp15.4基因的表达量均增加。相同茉莉酸甲酯浓度，随着诱导时间的增加，3个基因的表达量均增加；诱导时间1 h，3个基因的表达量均显著高于未诱导条件下的基因表达量。

茉莉酸甲酯浓度为100 μmol/L，处理30 min，dld、gln2、hsp15.4基因的表达量增加不显著；当茉莉酸甲酯浓度为200和500 μmol/L时，诱导30 min，3个基因的表达量均显著增加(见图8)。

(M．DL2000；1、4、7、10、13、16、19为dld基因；2、5、8、11、14、17、20为gln2基因；3、6、9、12、15、18、21为hsp15.4基因；1～3．驯化后无处理；4～6．无光培养1 d；7～9．正常光培养1 d；10～12．强光培养1 d；13～15．无光培养3 d；16～18．正常光培养3 d；19～21．强光培养3 d。M． DL2000; 1,4,7,10,13,16,19,dld; 2,5,8,11,14,17,20,gln2; 3,6,9,12,15,18,21hsp15.4; 1～3．Normal group (no treatment after one week cultivation within lab); 4～6．One cultivation day without illumination; 7～9．One cultivation day with normal illumination intensity; 10～12．One cultivation day with high illumination intensity; 13～15．Three cultivation days without illuminationy; 16～18．Three cultivation days with normal illumination intensity;19～21．Three cultivation days with high illumination intensity.)

图5 不同光照处理下基因的表达电泳图
Fig.5 The electrophoresis result of gene expression under different illumination intensity

(a．无光； b．正常光照；c．强光光照。图中不同小写字母表示相同光照强度下不同光照时间组的组间差异显著，相同小写字母表示差异不显著，P<0.05。a． No light condition; b．Normal illumination condition; c． High illumination condition. The different lowercase letters denote significant differences between the groups exposed to the same illumination under treatment of different times. The same lowercase letters denote insignificant differences between the groups exposed to the same illumination under treatment of different times.P<0.05.)

图6 不同光照处理下不同时间基因的表达量
Fig.6 Gene expression under different illumination conditions in different times

(M，DL2000；1、4、7、10、13、16为dld基因；2、5、8、11、14、17为gln2基因；3、6、9、12、15、18为hsp15.4基因；1～3．100 μmol/L MeJA培养30 min；4～6．200 μmol/L MeJA培养30 min；7～9．500 μmol/L MeJA培养30 min；10～12．100 μmol/L MeJA培养1 h；13～15．200 μmol/L MeJA培养1 h；16～18．500 μmol/L MeJA培养1 h。M: DL2000; 1,4,7,10,13,16:dld; 2,5,8,11,14,17:gln2; 3,6,9,12,15,18:hsp15.4; 1～3．30 minutes under 100 μmol/L MeJA condition; 4～6．30 minutes under 200μmol/L MeJA condition; 7～9． 30 minutes under 500 μmol/L MeJA condition; 10～12．1 hour under 100 μmol/L MeJA condition; 13～15． 1 hour under 200 μmol/L MeJA condition; 16～19．1 hour under 500μmol/L MeJA condition.)

图7 不同茉莉酸甲酯诱导条件下基因的表达电泳图
Fig.7 The electrophoresis result of gene expression under different MeJA conditions

(a．100 μmol/L； b.200 μmol/L； c.500 μmol/L。图中不同小写字母表示相同茉莉酸甲酯浓度下不同诱导时间组间差异显著，相同小写字母表示差异不显著，P<0.05。a.100 μmol/L MeJA conditions; b.200μmol/L MeJA conditions; c.500 μmol/L MeJA conditions. The different lowercase letters denote significant differences between the groups exposed to the same MeJA condition under treatment of different times. The same lowercase letters denote insignificant differences between the groups exposed to the same MeJA condition under treatment of different times.P<0.05.)

图8 不同茉莉酸甲酯浓度诱导下不同时间基因的表达量
Fig.8 Gene expression under different MeJA conditions in different times

3 讨论

龙须菜作为重要的养殖海藻，匮乏的栽培品种限制着龙须菜养殖规模的进一步扩大。寻找龙须菜育性控制基因，并探究其表达调控机理，可望为实现龙须菜育性调控及新品种的培育奠定基础。

龙须菜由无四分孢子囊(Ⅰ阶段)到形成大量四分孢子囊(Ⅱ阶段)代表着龙须菜由营养生长转变到生殖生长，这一时期高差异表达基因，极有可能在四分孢子囊形成过程中扮演着重要角色；在Ⅱ阶段 “981”与 “鲁龙1号”的差异表达基因则有可能与两者的育性差别存在联系。本研究通过对上述2组表达谱数据的筛选，找到了3个育性控制相关基因：dld、gln2、hsp15.4。

数字表达谱分析显示，3个基因在2个品种的不同发育阶段表现出不同的表达趋势(见表3)。在龙须菜四分孢子体发育的成熟期(Ⅱ阶段)，“981”中dld基因的表达量显著高于与“鲁龙1号”中该基因的表达量(p<0.05)。“981”在成熟期形成的四分孢子数量远低于“鲁龙1号”，相差1～2个数量级；在乳酸菌中，dld基因的高表达会抑制孢子的形成[8]。推测dld基因可能与龙须菜育性控制相关，其高表达与“981”的低育特性存在联系。蔡红梅在水稻花粉中发现的gln2基因的抑制表达会使水稻育性降低[11]。与dld基因的表达结果不同，表达谱分析结果中发现gln2基因在“981”成熟期(Ⅱ阶段)的表达量低于“鲁龙1号”(p<0.05)，证明了低育品种中gln2基因表达量要低于正常品种，gln2基因可能与龙须菜育性控制相关。赵建平等将热激蛋白基因分为3类：与发育阶段特异性表达相关的hsp基因、和发育阶段及胁迫诱导都相关的hsp基因、仅与胁迫诱导相关的hsp基因[22]。表达谱分析结果发现，hsp15.4基因在“981”成熟期(Ⅱ阶段)和成熟后期(Ⅳ阶段)的表达量均高于未成熟期(Ⅰ阶段)。龙须菜在放散四分孢子后，表面形成大面积创伤，hsp15.4基因在Ⅳ阶段的高表达可能与其抗逆特性相关。推测hsp15.4基因在龙须菜不同阶段发挥不同的功能作用，参与育性控制及抗逆表达调控。

表3 3个基因在2个品种的不同发育阶段表达谱数据Table 3 DGE data of three selected genes within different development stages of two cultivars

注：Gene ID:基因ID号；log2FoldChange:log2(Sample1_readcount/Sample2_readcount); log2Foldchange>0，则认为该差异基因是上调，log2Foldchange<0，认为该差异基因是下调；|log2Foldchange|越大，差异倍数越大。Gene ID: Gene ID in DGE; log2FoldChange: log2(Sample1_readcount/Sample2_readcount); log2Foldchange>0 means up-regulated gene expression, log2Foldchange<0 means down-regulated gene expression; The larger the |log2Foldchange|, the greater the difference.

本实验克隆得到了龙须菜dld基因，预测未发现信号肽，该结果与龙须菜gln2、hsp15.4基因一致，表明3个基因编码的蛋白质均为非分泌型蛋白。龙须菜dld基因编码氨基酸序列与脐形紫菜最为相近。跨膜区预测发现氨基酸序列存在2个跨膜区，说明其为跨膜蛋白。蛋白功能结构预测发现2～71 aa为低复杂性区域(LCR)，LCR是指该蛋白质片段中重复出现一种或少数几种氨基酸，氨基酸的多样性比较低[23]。LCR常与信号序列、疏水骨架、蛋白质稳定性等信息有关，LCR在蛋白质的含量随半衰期的增长而增多，长寿命蛋白质序列中含有低复杂度区域的可能性高于短寿命蛋白质[23]。龙须菜gln2序列中也存在2个跨膜区及LCR，且3个区域均为龙须菜中特有。这些序列结构可能是龙须菜在进化过程中产生的，使蛋白质具有独特的功能特征，如跨膜区可能使蛋白质具有附于膜上的能力。

基于dld基因编码的氨基酸序列构建的系统进化树结果印证了其分类关系，进化树中红藻与双子叶植物分为了2大类群，这说明在进化过程中，红藻与双子叶植物产生了分歧，从而形成了2个进化支，龙须菜处于红藻进化支中与脐形紫菜相近的位置。

启动子的调控在转录调控中占有十分重要的地位，对dld、hsp15.4、gln2基因启动子区序列进行分析，有助于探究3个基因的调控机理。植物启动子包括核心元件和一般上游元件，分析发现的dld、hsp15.4、gln2基因上游具有CAAT-box，这是绝大多数启动子正确启动转录所必需的。CAAT-box一般位于转录起始位点前25～30 bp 的区域内，是RNA聚合酶II结合位点，保证转录的精确起始，并调控上游激活蛋白[24]。除了参与调控真核基因转录的基本元件，3个基因上游序列中还具有多种响应元件，其表达可能受光照、激素和昼夜环境等影响。植物激素对红藻生殖发育具有调控作用，如精胺具有促进蜈蚣藻果胞成熟和释放的作用[25-26]；乙烯能够促进翼枝菜的四分孢子囊成熟[27]。茉莉酸甲酯是一种环戊烷衍生型激素，能够诱导生长相关基因的表达[28]。茉莉酸甲酯是具有明确抗逆作用的植物激素，能够促进龙须菜生长、提高体内渗透调节物质脯氨酸含量，同时能够提高龙须菜抗高温的能力[29]。

在众多的启动子元件中，预测得到的光照刺激响应元件最多。激素元件中，预测到茉莉酸甲酯响应元件最多，其中dld有4处，gln2有6处，hsp15.4有4处；其次是脱落酸，均为2处。在龙须菜中，光照和茉莉酸甲酯可以调控龙琼胶合成相关基因glgme、glmpg、glpmi和淀粉合酶基因glfss的表达，其中高光强可以促进基因的表达，茉莉酸甲酯调控基因表达具有时间积累效应[20]。说明在龙须菜中广泛存在光照与茉莉酸甲酯调控因素。

本研究对启动子元件Light responsiveness、MeJA-responsiveness设置诱导条件并检测其表达量，探究不同光照与茉莉酸甲酯是否可以调控dld、gln2、hsp15.4基因的表达。

不同光照条件诱导1和3 d时间，随着光照强度增加，基因表达量均提高；无光条件下处理1 d，基因的表达量低于无光处理1 d的表达量，且不同光照强度下无光处理组基因的表达量均低于有光处理组，黑暗条件下会抑制基因的表达，说明光是调控3个育性控制相关基因表达的一个重要因素。正常光照处理下，随着处理时间增加，基因表达量明显增加；高光照处理下，随着处理时间增加，基因表达量增加较少，说明高光照促进基因表达的作用，随时间增加而减弱。Zhou等通过设计正交实验研究龙须菜四分孢子最佳放散及发育条件时发现，适当增加光照强度和延长光照时长可以提高龙须菜四分孢子的放散数量以及发育速度，说明光照是调控龙须菜四分孢子体育性的环境因素之一[17]。

通过不同浓度的茉莉酸甲酯诱导培养，发现随着浓度和处理时间增加，dld、gln2、hsp15.4基因表达量均增加，说明茉莉酸甲酯也是一个重要的转录调控因子。低浓度的茉莉酸甲酯(100 μmol/L)在诱导时间达到1 h后可以使3个基因的表达量显著增加。相关研究发现，外源茉莉酸甲酯可参与调控红藻的育性性状表达[18]。Garcia-Jimenez等使用茉莉酸甲酯诱导培养红藻Gratelopiaimbricata和Pterocladiellacapillacea，结果发现其生殖结构的数量增多；观察Grateloupiaimbricate的囊果数量，统计结果表明茉莉酸甲酯处理后的藻体产生囊果数量较对照组显著增多，且成熟周期缩短，放散量增加[18]。

本研究通过对龙须菜四分孢子体不同发育阶段差异表达基因的分析，得到了与育性控制相关的基因dld、gln2、hsp15.4，完成了dld基因的克隆及3个基因的刺激响应研究，为阐明龙须菜育性控制机理和通过外部条件调控基因表达及藻体发育提供了可能。