甜菊糖生物合成相关基因的研究进展

倪洪涛，董花，周艳丽

（1.黑龙江大学农业资源与环境学院，哈尔滨150080；2.甘肃省武威市凉州区农产品质量安全监督管理站，武威733000）

0 引言

甜菊糖以天然无毒、零卡路里等特性受到世界消费者的青睐[1]，国内外对甜叶菊生产发展非常重视，掀起了研究热潮[2-6]。甜叶菊的生长发育，甜菊糖（Steviol glycosides，SGs）的生物合成、代谢、运输等活动均有基因的参与、调节和控制。商用的蛇菊苷（Stevioside，STV）和莱鲍迪苷A（Rebaudioside A，Reb A），是经甲基赤藓糖醇（MEP）途径，由最初的物质丙酮酸和甘油醛-3-磷酸在各种酶的催化作用下，一步步先合成牻牛儿牻牛儿焦磷酸（GGPP），此之前称为早期阶段；然后GGPP在4种酶基因：SrCPPS、SrKS、SrKO和SrKAH作用下转化为甜菊醇（Steviol），之后在3个UDP-葡糖基转移酶（UGTs）基因SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1的作用下形成STV和Reb A，整个过程共有15个酶基因参与；GGPP之后称为晚期阶段[7-9]。甜菊醇第一个糖基化（单一糖基化）是由SrUGT85C2作用在13位上羟基产生甜菊醇单糖苷，甜菊醇单糖苷进一步在13葡萄糖2位位置糖基化产生甜菊醇双糖苷，在SrUGT74G1作用下将19位羧基糖基化，产生甜菊醇三糖苷（STV）；STV在甜菊叶中含量最高，约是蔗糖甜度的250～300倍，STV进一步经SrUGT76G1糖基化产生甜菊醇四糖苷（Reb A），这被认为是最甜的（是蔗糖甜度的350～450倍）、味道品质好的糖苷[1]。GGPP作为几个异戊二烯生物合成的中间物，因此分析和调控GGPP生物合成主导地位的基因，可能会控制植物二萜的合成。研究表明，晚期阶段的SrCPPS、SrKS、SrKO、SrKAH，SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1等酶基因在调控SGs含量具有非常重要的作用[7，9]。SGs的生物合成过程与赤霉素（GA）生物合成密切相关，甜叶菊叶片细胞内GA合成过程中的一些酶含量及其活性都比较高，这将导致GA和甜菊糖的共同前体物质贝壳杉烯酸的大量积累，为避免合成过量的GA，这些前体物质在各种酶的作用下被转化为甜菊醇，甜菊醇被糖基化形成甜菊糖（STV和Reb A等）[10]。因此搞清这些酶基因的作用机理，可有意地、更好地调控甜菊糖的生产量和品质。本文主要综述了甜菊糖生物合成途径相关酶基因的研究进展，为改善甜菊糖的生产提供参考。

1 参与甜菊糖生物合成途径的酶基因

1.1 UGTs基因

1.1.1 基因的克隆、表达与分析

通过深入转录分析，为甜叶菊基因鉴定提供了契机。Chen等使用转录组测序给出了3个不同SGs组分的甜叶菊基因型转录谱的全貌，生成了191 590 282个高质量测序，然后组装成平均序列长度969碱基对的171 837个转录，总共有80 160个单一基因注释，14 211个独特的序列是由《京都百科全书》基因和基因组指定的特定的代谢途径。对参与SGs合成的所有酶基因序列进行了测定，总共143个UGTs基因被鉴定，其中的一些可能参与SGs的生物合成。RNA序列分析确定候选基因编码的酶负责SGs的生物合成[11]。Totté等采用逆转录PCR，克隆了SrDXS和SrDXR的cDNA序列，测知分别含有2 148和1 422个核苷酸的开放阅读框，其氨基酸序列包各含716和474个残基，分别编码76.6和51 kDa的多肽[12]。

马凌波克隆得到了甜叶菊类黄酮UGTs基因，与其他同类UGTs基因的氨基酸序列相似性高达53%～70%，约45%的氨基酸序列完全一致。扩增获得甜叶菊UGTs基因UGT1和UGT2的全长分别为1568bp和1662bp，开放阅读框分别为1 419 bp和1 362 bp，各编码473个和454个氨基酸；二者共有44个氨基酸特征性的保守序列，与常见的UGTs基因的相似性分别达26%～46%和44%～74%。UGT1作为甜叶菊体内的类黄酮UGT，具有广泛的底物特异性，既参与类黄酮的糖基化，又能作用于甜菊醇，形成甜菊糖，当形成大量的GA前体物质、使甜叶菊的正常代谢受到威胁时，UGT1等基因就会起作用将其合成STV和Reb A等甜菊糖[10，13]。苏樨州[14]、董振红[15]、刘欢等[16]和杜婷[17]进行了甜叶菊SrUGT76G1基因克隆到酵母中表达的研究。UGT在糖苷的合成中具有显著优势，但其分离纯化较难和所用底物昂贵的原因，致使糖苷酶促合成的成本高。尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）是最常见的糖基供体。蔗糖合成酶可催化蔗糖和UDP生成果糖和UDPG，该反应与UGTs所催化的糖基转移反应偶联，可有效地循环再生UDPG。可在甜叶菊糖基转移酶基因SrUGT76G1的作用下，以UDPG为糖基供体，特异性催化STV合成Reb A[17]。因此，杜婷采用两步PCR的方法，合成拟南芥蔗糖合成酶AtSUS1的编码基因，并将其亚克隆到携带SrUGT76G1基因的表达质粒上，构建了双酶共表达质粒，将其转化到大肠杆菌进行诱导表达。首次成功进行了蔗糖合成酶基因的合成，初步建立循环利用UDPG的“一锅双酶”催化体系，比较添加UDPG和UDP的反应体系，只需要添加相对廉价且远低于理论值用量的UDP为起始底物，大大降低了生产成本[17]。Yang等分析了约500样品（杂交后代）叶子的STV和Reb A含量，发现一个突变株“Z05”的Reb A水平非常低，因为SrUGT76G1基因负责STV转换为Reb A，所以通过测序候选基因SrUGT76G1来鉴定突变体。同时，发现一些氨基酸替换显著改变蛋白质结构，因此，无序突变和氨基酸替换突变导致Reb A水平非常低[18]。张虹等以6个甜叶菊品种为材料测定SrUGT76G1、SrUGT85C2和SrUGT91D2m三个关键酶基因的表达量，结果显示SrUGT76G1基因相对表达量与Reb A含量有极显著相关关系，而SrUGT85C2和SrUGT91D2m基因表达量与Reb A含量无相关，说明SrUGT76G1基因的表达对Reb A合成有着较为重要的影响，有望利用基因工程手段人为调控甜菊糖的生物合成、提高RebA的含量[19]。郭书巧等进行了甜叶菊SrUGT76G2基因克隆到酵母中表达的研究。从甜叶菊叶片中分离了分子量为52.029 kD由458个氨基酸残基组成多肽的与甜叶菊SrUGT76G1高度同源的SrUGT76G2基因，与SrUGT76H1有35%的一致性，个别位置氨基酸存在差异；SrUGT76G2基因在甜叶菊不同组织中具有表达特异性，在叶中的表达丰度较高，在茎中表达较低，在根中不表达[20]。

Madhav对甜叶菊12个UGTs的3个UGTs-SrUGT76G1、SrUGT74G1和SrUGT85C2功能基因组学在STV合成进行了研究。一个UGT基因命名SrUGT显示与SrUGT76G1相似，SrUGT在成熟叶的表达水平相对较高。尽管与SrUGT76G1基因核苷酸有相似性，基因SrUGT在蛋白质二级和三级结构有48个SNP和39个关联氨基酸替换的显著变化。在SrUGT观察到一种新的氨基酸的存在呈螺旋状变化，氨基酸、保守组氨酸和阿斯巴甜残留氢键异常替换，支持甜叶菊其它UGTs功能的稳定性和特异性。基于这些特点，SrUGT表现了不同于甜叶菊其他UGTs的新情况[21]。甜叶菊中SGs生物合成途径和GA的生物合成路径为共同起源的不同分支，异贝壳杉烯酸（KA）做为分枝，MEP途径的底物，也导致GA合成[17，21]。Guleria等研究农杆菌介导瞬时基因沉默（AMTS）RNA干扰（RNAi）途径。在甜叶菊SrKA13H和3个SrUGTs（SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1）基因分别编码KA和SGs生物合成途径的3个UGTs基因沉默，来理解其分子机制及与GA的关系。发现SrKA13H和3个SrUGTs基因的AMTS的RNAi显著地降低内源基因的表达及总SGs的积累；而赤霉素（GA3）含量显著增强了SrUGT85C2和SrKA13H的AMTS。SrKA13H和SrUGT85C2的沉默阻止了SGs途径的代谢通量而转向GA3的生物合成。证实SrUGT76G1合成SGs的替代途径底物的亲和力最高，SrUGT76G1沉默使SGs含量降到最低。结论：SrKA13H和SrUGT85C2被确定为影响SGs和GA生物合成的碳通量调控基因[22]。用甜叶菊转基因拟南芥SrUGT85C2基因过量表达来检测对GA积累及植株生长参数的影响，转基因株显示GA3含量减少78%～83%，并表现GA缺陷表型，包括下胚轴长度发育不良，芽生长减少，相对含水量显著下降，叶绿素a和叶绿素b含量分别减少17%～37%和64%～76%。减少光合色素可能显著降低植物生物量，如SGs和GA的生物合成，在质体MEP途径，叶绿素生物合成前体也由IPP和DMAPP生成。在转基因株MEP途径酶的编码基因SrGGDPS、SrCDPS、SrKAO、叶绿素合成酶和叶绿素a氧化酶基因下调表达，SrUGT85C2超表达可能降低GA和叶绿素含量[23]。甜叶菊的叶片由SrUGT74G1编码的UGTs催化将甜菊双糖苷转化为STV。以转拟南芥基因SrUGT74G1 cDNA的超表达来开发STV生物合成的可能性。然而，在转基因株中STV积累不明显。同时，转基因拟南芥株在GA3含量的SrUGT74G1超表达没有变化，而儿茶素却显著积累，转基因株的芽长、根长和丛生面积均增加，自由基清除作用增加了；转基因株种子产量也比对照增加6%～15%[24]。对甜叶菊微繁殖30 d进行候选基因转录分析，结果，15个候选基因转录中，有9个上调两倍以上，转录差异与STV含量（由0 d的11.48%增加到30 d的13.57%）显著提高相关[25]。

1.1.2 外源调节物质处理对基因的影响

研究表明，不同器官中SGs生物合成途径的15个基因表达与SGs含量有关系，SGs积累量在叶组织最大，其次在茎秆和根，15个基因的表达模式亦如此。这些基因回应并调节萜类的生物合成。GA3处理SrUGT74G1基因表达上调，而茉莉酮酸甲酯（MeJA）和激动素处理15个基因表达下调[8，26]。在可控温室条件甜叶菊植株经聚乙二醇（PEG）、GA和PBZ处理，GA和PBZ处理分别增加和减少了STV，Reb A、B、C、F，甜茶苷，甜菊双糖苷，杜尔可苷A和总SGs含量。PBZ处理提高了Reb A/STV比，这意味着甜叶菊提取物的余味苦味降低了；GA处理没有显著影响这个比例。不同处理下Srent-KS1-1、Srent-KAH和SrUGT74G1的转录相当稳定，而PBZ和PEG处理下Srent-KO、SrUGT85C2和SrUGT76G1的转录显著降低。PBZ和PEG处理对基因的转录均产生负面影响，而GA处理则相反[27-28]。Khan等将甜叶菊叶外植体经一系列的EMS和γ辐射处理，所有处理中，甜菊糖的增加是由于SrUGT74G1和SrUGT76G1分别执行STV和Reb A的生物合成。EMS处理植株的SrUGT74G1和SrUGT76G1基因表达增加5～6倍；而γ辐射处理植株的SrUGT76G1基因表达增加5倍[29]。通过应用PEG（5%、10%和15%）模拟干旱胁迫研究了SGs的含量及其相关的6个基因转录水平。PEG处理使SrKS、SrKO、SrKAH和3个SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1的转录水平下调，显著降低STV，Reb A、B、C和F，甜菊糖双苷，甜茶苷和总SGs的含量。表明，SGs生物合成途径中SGs含量与基因的转录密切相关。因此，PEG诱导干旱胁迫对SGs含量和SGs生物合成基因转录有负面影响，建议：甜叶菊实施充分的灌溉以获得高含量的SGs[30]。在干旱胁迫下SrUGT74G1、SrUGT76G1和SrUGT85C2基因参与STV到Reb A生物合成途径的表达，SrUGT76G1基因的转录水平明显高于SrUGT74G1和SrUGT85C2基因，SrUGT76G1基因是由STV到Reb A合成途径的主要基因[31]。

1.1.3 外部环境因素对基因的影响

外部环境因素如光、温、水可影响植物生长和次生代谢。SGs生物合成途径的15个基因的转录水平在15℃～25℃达最大，低于15℃和高于35℃下，SrUGT85C2和SrUGT76G1的转录受到抑制；在水胁迫下大多数基因表达下调。在生长阶段SGs的含量有明显的变化，在快速生长时期15个基因的转录水平是最小的，在现蕾阶段和开花阶段表现出明显的增加。说明，环境因素对甜叶菊SGs含量和相应的生物合成基因转录的影响是显著的[32]。3个UGTs的候选基因SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1的翻译产物，对STV和Reb A的合成有活性，在3、6和9d灌溉间隔下（对应土壤含水量分别为田间容量的90%、75%和60%）土壤含水量75%时导致SrUGT85C2和SrUGT74G1基因表达显著增加，而在土壤含水量60%时SrUGT76G1基因表达显著增加。在土壤含水量60%时SrUGT76G1的转录和Reb A积累显著相关。在75%和60%土壤含水量，SrUGT74G1转录显著高于S rUGT85C2和SrUGT76G1。这些结果表明，Reb A/STV比的最高值是土壤含水量60%、9d灌溉间隔，可通过这些基因的上调和下调来改善糖苷的产质量[33]。

由基因转录分析红LED灯对SGs合成的效果。植株生长在短日照（8 h；SD）、长日照（16 h；LD）或短日照在夜间用红LED灯处理（SD+LED）。处理76 d后，SD组完全开花，其余各组仍处于生长状态。植株发育后一些生物合成基因的转录降低，尤其是Srent-KS和SrUGT85C2基因，而其他的基因基本上保持不变。LD和SD+LED组或两组之间幼苗植株个体发育很少或无显著变化。基因转录可能主要受个体发育的影响，其本身受光周期的影响。在这些条件下，红LED灯影响基因的转录，间接影响营养生长。在红LED灯LD下可延长营养生长甚至更长。转录水平为：S rUGT74G1＞SrUGT85C2＞Sr ent-KAH＞SrUGT76G1＞Srent-KS＞Srent-KO，基因转录与产物间无显著相关，不同基因间的转录水平有显著相关性[34]。在红/远红光（R/FR）1.22发光二极管（LED）和蓝色LED处理下，参与催化糖转移反应的SrUGT85C2转录较高。表明，SGs相关基因的转录水平和SGs含量受光处理的影响而影响GA含量。该方法可作为光处理提高SGs含量的实用方法[35]。

在体内外繁殖的植株不论是老的或年轻叶片STV和Reb A浓度都很高，在节点和节段SGs含量较低，但体外高于体内繁殖株。SGs含量与参与SGs生物合成的SrUGT76G1和SrUGT74G1转录水平间存在显著的相关关系，因此，在体外培养条件下不影响SGs的合成和积累能力[36]。

1.2 甜菊糖生物合成途径的其它酶基因

1.2.1 基因在不同组织的表达

甜菊叶积累的混合物至少有8个不同来源的四环二萜甜菊醇，有与GA类似的生物合成起源。GA形成的初始步骤是：由SrCPS和SrKS催化GGDP到贝壳杉烯。已经从甜叶菊分离出两个SrCPS和SrKS基因，发现重组SrCPS和SrKS催化是活跃的，这表明SrCPS和SrKS基因参与甜菊醇的生物合成，编码SrCPS和SrKS的基因通常存在于大多数植物的单个拷贝中，其表达是通常低且限于迅速生长的组织。SrKS基因已在甜叶菊基因组中复制，SrKS和SrCPS基因在成熟的叶片高表达，而GA生物合成模式却相反[37]。甜叶菊叶片产生高浓度的二萜SGs，参与二萜合成的转录源很丰富。为了开发基因资源和增加对SGs生物合成的理解，从甜叶菊叶片cDNA文库测序了5548个ESTs。ESTs一个显著的部分是标准叶代谢途径所特有的；能量代谢和初级代谢分别为总转录的17.6%和13.1%，二萜代谢占总转录的1.1%。鉴定了SGs途径的70%候选基因，其中一个候选基因SrKO是ESTs集合中第八个最丰富的基因。鉴定的SrDXP途径的许多特异候选基因表明，GGDP的前体异戊烯基焦磷酸是通过非甲羟戊酸途径生成的。EST的使用大大促进了候选基因的鉴定及增加了我们对二萜代谢的理解[38]。

郭书巧等利用RT-PCR方法从甜叶菊叶片中分离了与SGs生物合成密切相关的基因SrKA13H，该基因编码分子量54.476 kD由476个氨基酸残基组成的多肽，是典型的细胞色素P450基因，SrKA13H在甜叶菊根、茎、叶和花组织中呈组成型表达，叶和花中的表达丰度较高。推测SrKA13H可能在SGs生物合成过程中发挥重要作用[39]。Kumar等测定了 SrMCT、SrCMK、SrMDS、SrHDS、SrHDR、SrIDI和 SrGGDPS七个基因的全长cDNA序列，分别为1 241 bp、1 500 bp、870 bp、2 599 bp、1 629 bp、1 048 bp和1 245 bp，开放阅读框分别为954 bp、1 215 bp、696 bp、2 223 bp、1 377 bp、699 bp和1 086 bp。与其他节段位置的叶子相比，第三个节段的位置叶子（顶端叶为第一叶）的SGs含量最高。除SrDXR和SrKO，在第一节段和第五节段叶中基因的表达最大和最小；SrKO在第三节段叶片表达最高，而SrDXR在第三节段叶片表达增加以后逐渐下降。GA3处理S rMCT、SrCMK、SrMDS基因表达上调[8]。低于 15℃和高于 35℃下，SrDXS、SrDXR、SrMCT、SrCMK、SrMDS、SrHDS、SrHDR、SrIDI、SrGGDPS、SrCPPS1、SrUGT85C2和SrUGT76G1的转录受到抑制[32]。甜叶菊产物不仅是双萜类糖苷，还有其它的半日花烷型二萜（LDT）。分析表明在甜叶菊叶片细胞中SGs累积；在表皮毛中含有LDT，如氧代泪柏醚和贝壳杉醇酸。这些代谢物由转录组引导，明确了特定基因在MEP编码酶和甜菊醇或其它LDT的生物合成。SrCPS2和SrKSL在表皮毛中表达；SrCPS和SrKS1体内外植株的表达是不同的；SrCPS2与SrKSL联合催化生成泪柏醚和上泪柏醚。表明，甜叶菊叶片组织进化到使用不同的代谢途径以避免代谢干扰来产生不同的次级代谢产物[40]。一般通过MEP途径合成SGs、GA、色素和其他异戊二烯基次生代谢产物。为阐明甜菊醇的作用，进行了甜菊糖前体引导植株叶组织STV生物合成的培养试验，前体或诱导子负责刺激叶中STV的生产。对根和叶中参与STV生物合成基因转录分析，发现参与甜菊醇生产的关键酶SrKAH的转录在根和叶组织中相同。然而，当这些植株以前体甜菊醇处理，在该途径的多数基因表现为下调表达。有趣的是，需要很小浓度的前体来提高该途径基因的转录水平[41]。

1.2.2 外部因素对基因表达的影响

将矮壮素添加于MS培养基（添加萘乙酸、激动素、噻苯隆），测定了矮壮素对体外培养的形态发生、抗氧化剂活性、SrKA13H基因表达水平的影响。结果，矮壮素对离体形态有显著作用，对叶子外植体胚性愈伤组织形成、愈伤组织和生根效率有促进作用。矮壮素也促进了甜叶菊叶片SrKA13H基因表达水平[42]。甜菊醇是STV和Reb A的脂溶性构架，是叶绿体萜途径经SrKA13H调解由KA合成。MeJA（20μmol/L）体外处理诱导糖苷生物合成显著，而高浓度MeJA（100μmol/L）导致糖苷的生产和增长降低，处理后3d，植株中糖苷含量最高。MeJA处理后6～48h也增强SrKA13H基因的表达[43]。在植物生长室和大田实验表明SrMDS是一个光调控基因。吲哚乙酸（50、100μmol/L）处理4 h下SrMDS基因下调表达，而脱落酸无调节表达。在白天光照下SrMDS表现高表达（与黑暗时间相比）[44]。SGs的一部分合成是通过质体MEP途径进行，其中HDR是关键酶。甜叶菊的SrHDR在遗传互补成功救援HDR致死突变株MG1655，表明SrHDR编码功能蛋白。该基因表现昼夜差异，SrHDR在光照下最大限度地表达，即在06：00时光照强度580μmol/(m2·h)和10：00时光照强度1 665 μmol/(m2·h)；在暗期（20：00时；探测不到光）无表达[45]。

Mandal等接种丛枝菌根真菌（AMF）比较了SGs生物合成途径的11个主要基因的转录。结果，AMF植物的基因编码MEP途径酶，即SrDXS、SrDXR和SrMDS为负转录调控。提高AMF植物对锌和锰的吸收会增强SrMDS的转录。AMF植株SrCPPS和SrKAH的转录表达增强，对SGs的生物合成起重要作用，SrCPPS调节代谢物质合成KA前体，SrKAH引导这些甜菊醇代替GA合成。通过4个特定的UGTs指令使甜菊醇糖基化为Reb A，以SrUGT76G1转录水平最高，特别改善了Reb A/STV比，使甜味品质增强[46-47]。Guleria等测定了拟南芥对甜叶菊SrKA13H cDNA的异位表达，与对照比，两个拟南芥转基因株系的SrKA13H基因超表达使甜菊醇含量（1～3μg/g DW）显著增加；其内源性生物活性调节物质赤霉素均减少，表现为GA缺乏突变体的表型性状；内源GA含量减少会出现转基因侏儒症，外源GA3可拯救转基因侏儒症。0.2～1.0μg/mL外源甜菊醇的应用不影响花粉萌发。在拟南芥转基因植株中甜菊醇的形成没有变化，种子产量却降低24%～48%[48]。

1.2.3 miRNA调节生物合成途径的基因

miRNAs作为基因表达的调节器，在调节SGs生物合成途径的基因网络起重要作用，测定表明所有的miRNAs在甜叶菊叶、茎和花3个组织的表达不同，其表达水平与SGs含量有一定关系。分别有8、6、4、3和1个miRNA以生物合成途径中的SrUGT85C2、SrKO、SrKAH、SrKS和SrUGT76G1作靶标基因，SrUGT85C2是miR319a、miR319b、miR319c、miR319d、miR319e、miR319f、miR319g和miR319h的靶标基因，其中，除miR319h外7个miRNA均显示多位点的相互作用；SrKO是miR319a、miR319c、miR319f、miR319g、miR319h和miRstv_9的靶标基因；SrKAH是miR319a、miRstv_7、miRstv_9和miRstv_11的靶标基因；SrKS是miR319b,miR319d,miR319g靶标基因；SrUGT76G1是miRstv_7的靶标基因。掌握这些遗传调控，可能协助选择和操纵得到高效植物基因型[47，49]。

2 其它途径的基因

在生物细胞内，钙调蛋白（CaM）与钙离子结合激活一些靶酶和非酶蛋白质，与靶酶相互作用调控生物体的生长发育及对外界胁迫的反应和适应能力。熊玲媛等克隆甜叶菊SrCaM基因得到了两个异型基因，二者均由450个核苷酸组成，编码148个氨基酸，85%的核苷酸序列同源，99%的氨基酸序列同源，其差异是仅在第122个氨基酸由丙氨酸代替了缬氨酸。初步分析表明SrCaM是进化过程中极保守的蛋白，在生物的代谢和生长发育过程中是必不可少的。甜叶菊SrCaM基因在大肠杆菌中得到表达。为了能在植物中表达绿色荧光蛋白（GFP），通过PCR扩增将改良的GFP基因GFP-mutZ连入到中间载体，构建了带有GFP-mutZ的植物双元表达载体，在农杆菌介导下对甜叶菊愈伤组织进行转化，用潮霉素（HYG）作为抗性筛选剂进行筛选，检测显示，双元载体上GUS基因在甜叶菊细胞中已得到表达，外源GFP基因己整合到甜叶菊愈伤组织的基因组中，在转基因甜叶菊愈伤组织中己获得了表达[50-51]。

3 展望

未来的甜菊糖研发方向：⑴创造预期的条件，有意增强或降低某种酶基因的浓度，使之向着需要的糖苷方向生产；⑵建立廉价有效循环再生的糖基供体的多酶催化体系，降低原料生产成本；⑶Reb A甜度虽高，但高浓度回味仍具苦味，Reb C只是葡萄糖甜度的30倍，含量低的五糖苷Reb D和六糖苷Reb M及其共混物甜度高达蔗糖的350倍，并极大降低了苦味[52]。在测试中Reb D是最甜的，明显比Reb B苦味低；与Reb A等相比，Reb M是具高甜度、快速和干净的味道，大大降低了甘草、苦、酸苦涩的回味。这些特性使Reb D和Reb M成为优质的高潜力的天然甜味剂。Reb D和Reb M只存在于甜叶菊叶且含量极低（0.4%～0.5%），从甜叶菊中提取是不切实际和昂贵的。编码的SGs包括Reb D和Reb M生物合成的基因已被鉴定，SGs的途径已在酵母中成功表达，微生物提供了Reb D和Reb M的异源生产替代[53]。因此，有望借助微生物实现工厂化生产下一代甜叶菊甜味剂，有能力控制不同的基因表达并能修饰酶的底物特异性。