免疫亲和柱在真菌毒素检测中的应用

□ 路雅婷 中国海洋大学食品科学与工程学院 淄博市食品药品检验研究院

1 引言

在自然界中，存在着大量的真菌毒素，有关统计数据显示，全球大约有25%的农产品会受到不同程度的真菌毒素污染，因为霉变污染而引起的真菌毒素，造成的农产品和工业原料损失每年可以达到数百亿美元，真菌毒素对食品的生产者和消费者造成的伤害不容小觑。常见的真菌毒素的检测方法有免疫分析法和仪器分析法，免疫亲和高效液相色谱荧光检测技术是当前真菌毒素检测能力验证中发展最成熟、应用最广泛的检测技术。王韦岗[1]等建立了复合免疫亲和柱－在线光化学衍生－高效液相色谱同时测定谷物及其制品中9种真菌毒素的检测方法，该方法重现性好、灵敏度高、结果准确。真菌毒素免疫亲和柱主要利用真菌毒素抗体作为配基来吸附真菌毒素，具有较好的靶标识别性和特异性，可以去除样品基质干扰，降低真菌毒素净化的损失，提高结果的准确性，适用于混合粮食和油料基质中低浓度真菌毒素的检测[2]。本文对免疫亲和柱在真菌毒素检测中的应用进行了相关的总结与分析，为免疫亲和柱的应用与发展提供一定的理论基础。

2 真菌毒素的概念

真菌毒素是真菌在适宜的温度和湿度条件下，发生次级代谢反应从而产生的有毒代谢产物，粮食和饲料卫生安全部门又将其称为霉菌毒素，真菌嗜氧，在无氧条件下，真菌几乎无法存活，因此人们为了避免谷物被真菌毒素污染，一般会使用真空和氮气储存的方式，从而有效防止真菌毒素的产生。目前，相关研究已经分离和鉴定出来的真菌毒素种类有400多种，但是在粮食行业领域中，常见的主要有黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮与赭曲霉毒素A4种真菌毒素[3]。

2.1 真菌毒素的来源

真菌毒素的来源大致分为2类：作物收获前的真菌毒素污染，作物收获后的真菌毒素污染[4]。

2.1.1 收获前的真菌毒素来源渠道

任何在生长阶段的农作物，包括饲草以及谷物等，在受到真菌污染时，都极易产生真菌毒素。真菌在跟随农作物由田间向饲料加工厂再到饲料槽的这一流转过程中，不太可能会存活下来，即使有少部分的真菌存活下来，而在检测饲料的常见指标时，如果饲料的原料成色以及外观看起来都很好，那么这些看起来成色以及外观很好的饲料原料就有可能成为真菌毒素的避难所。

2.1.2 收获后的真菌毒素来源渠道

收获后的农作物，如果其储存、运输、加工的温度以及湿度条件满足真菌生长的外部环境需求，那么真菌就会继续生长，直至霉变产生真菌毒素。如果粮食、饲料在收获储存过程中，没有充分进行干燥处理，在储运过程中温度和湿度过高，就会导致真菌迅速生长，这时真菌毒素就会大量产生，最终导致动物机体受到危害。

2.2 真菌毒素的特点

2.2.1 高效性

毒素浓度较低的真菌毒素依然可以产生十分强大的毒性，在粮食、饲料中常见的几种真菌毒素中，黄曲霉素B1的毒性最强，其毒性强度是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，被世界卫生组织肿瘤研究机构定义为一类致癌物质。并且黄曲霉素B1十分普遍，在农作物和饲料中广泛存在，黄曲霉毒素主要损伤人体的肝脏器官，使其产生癌变、畸形、病变等反应，主要引发肝癌，甚至会引发骨癌、肾癌、直肠癌与乳腺癌等。

2.2.2 高稳定性

真菌毒素属于低分子化合物，其结构十分稳定，耐高温。黄曲霉素的化学性质十分稳定，即使是在100℃的高温条件下储存20h也无法完全消灭，需要温度达到280℃的高温条件，才能破坏其化学性质。

2.2.3 富集性

真菌毒素具备抗化学与物理试剂的特点，可以在生物链中传播、富集。在土壤中的真菌毒素会被谷物吸收，从而引起真菌毒素污染问题。

2.2.4 特异性

真菌毒素的分子结构不同，其产生的毒性差异十分大，比如黄曲霉毒素就有B1、B2、M1与M2等结构类型，它们的毒性各不相同。

2.2.5 相加性

2种以上的真菌毒素混合在一起产生的毒性远远大于单一毒素累加产生的毒性，农作物大多是被几种真菌毒素混合污染的，因此饲料中很有可能同时存在几种真菌毒素。

2.2.6 污染地域性

动物饲料以及农作物中的真菌毒素都有一定的地域性特点，比如，热带和亚热带地区的真菌毒素大多都是曲霉菌毒素，但是，由于贸易的全球化发展，导致饲料农作物的真菌毒素依然会在全球范围内传播。

2.2.7 隐蔽性

真菌毒素在检测时常会受到小分子物质比如糖苷、葡糖苷酸、脂肪酸酯和蛋白质等物质的覆盖，这些小分子物质会与真菌毒素的分子结构融合在一起，导致检测值显示阴性，真菌毒素被掩盖，传统的检测分析方法是无法检测出来的，但是这些与真菌毒素所结合的小分子物质，会在人体消化过程中被分解掉，从而将真菌毒素释放出来，导致人体和动物的健康受到危害。

3 免疫亲和柱概述

免疫亲和柱是免疫亲和层析柱的简称，也常常被称为亲和柱、亲和层析柱等，它是运用抗原抗体的特异性、可逆结合特性的SPE技术，根据抗原抗体的高选择性，从复杂结构的待测样品中提取出一种目标化合物。它的主要原理是将抗体惰性微珠进行等价结合，然后将其装柱，再将抗原溶液通过免疫亲和柱，最后用洗脱缓冲液将抗原洗脱出来，最后得到纯净的抗原。

3.1 免疫亲和柱的抗体来源

免疫亲和柱使用的抗体可以通过单克隆技术进行制作，也可以通过多克隆的方式制作，多克隆的抗体制作工艺十分简单，效用也十分高，但是容易产生交叉反应，批次生产的抗体之间的差异很大；单克隆抗体制作工艺相对复杂，它是通过杂交瘤细胞传代培养的方式产生的，特异性较高，可以有效防止批次生产的差异，产品质量十分稳定[5]。

3.2 温度对实验结果的影响

抗原抗体发生反应的最佳温度是在25℃左右，因此实验环境的温度最好控制在25℃左右，过高或者过低都会影响到亲和柱的回收率，如果亲和柱是在4～8℃的环境中保存的，那么在进行实验时最好将亲和柱的温度恢复到25℃左右，0℃以下的环境对于实验十分不利。

4 免疫亲和柱在真菌毒素检测中的应用

针对黄曲霉素系列的B1、B2、G1、G2与 M1，伏马菌素 B1、B2，玉米赤霉烯酮，棕曲霉毒素A以及脱氧雪腐镰刀菌烯醇等真菌毒素的免疫亲和柱已经实现了商品化，其他真菌毒素的免疫亲和柱，如桔青霉素、展青霉素、杂色曲霉素等的单克隆抗体也已研发出来，但是相关的免疫亲和柱产品还未出现。

4.1 黄曲霉毒素

近30年来，食品与饲料中的黄曲霉毒素污染问题一直是人们关注的重点问题，这种毒素是由黄曲霉属的真菌在食物或者饲料中长期生长而产生的一种有毒代谢物。当温度与湿度条件达到真菌生长环境需求时，黄曲霉属真菌就会无限繁衍，并产生黄曲霉毒素，黄曲霉毒素对人体和动物的危害十分严重。选用适当的测定方法对食品中的黄曲霉毒素进行测定已经成为了行业领域广泛关注的一个问题。Matumba L等[6]采用免疫亲和柱与酶联免疫吸附法结合的方式对土耳其市场上75个胡椒粉样品进行了检测，这75个胡椒样品中，黄曲霉B1的含量在0.11～24.7 μg/kg，其中有一个样品的黄曲霉毒素含量高于国家规定的限量值；2011年，杨小丽等[7]对动物类药材中的黄曲霉毒素进行了测定，样品在经过提取之后，通过免疫亲和柱进行净化，最后得到的回收率在78.8%～106.7%，证明免疫亲和柱在黄曲霉毒素检测中的灵敏度和重现性良好，适用于动物类药材中的黄曲霉毒素的定量分析。在2003年，国家发布的黄曲霉素测定文件中，也将免疫亲和柱作为净化黄曲霉毒素的标准分析方法。

4.2 伏马毒素

伏马毒素的检测方法主要有高压液相色谱法、TLC法和酶联免疫吸附法3种，但是随着免疫亲和柱法在真菌毒素检测中使用的不断推广，一些研究者也逐渐开始使用免疫亲和柱法对伏马毒素进行净化，发现其净化的灵敏度与抗干扰能力很强，丝毫不比其他几种测定方法逊色。Solfrizzo M等[8]使用免疫亲和柱与高压液相色谱法结合的方式对婴儿玉米粉中的伏马毒素B1和B2进行了萃取，测定出样品的加标浓度，伏马毒素B1约 80 ～ 800 μg/kg，伏马毒素 B2约20～200 μg/kg。2010年，国家发布了相关的文件，将免疫亲和柱作为伏马毒素净化萃取的标准方法。

5 结语

我国的谷物霉变灾害主要发生在长江以南的地区，每年因为霉变污染导致的粮食减产比例在3%～7%。有关调查显示[9]，除了粮食、饲料中存在真菌毒素污染问题以外，在油料作物、种子、蔬菜、干果、调味品、烟草与乳制品等产品中都发现有不同程度的真菌毒素污染问题，真菌毒素污染给人体带来的疾病与伤害不可估量。免疫亲和柱具有高灵敏度、检测速度快、操作简便等特点，在真菌毒素的检测中具有良好的效果，因此，应不断研发和推广免疫亲和柱在真菌毒素检测中的使用深度与广度。