白塞氏病患者血浆中微小RNA异常表达的初步研究

苗 慧，张新桥，王 红

0引言

葡萄膜炎是一类常见的眼病，治疗棘手，易于反复发作，治疗不及时或处理不当易致盲，其主要影响青壮年人群的身心健康，受到全球眼科学界的重视[1]。多数观点认为，葡萄膜炎是由自身免疫紊乱所致，自身免疫性葡萄膜炎主要是由Th1细胞群(主要介导细胞免疫)、Th17细胞群(主要介导炎症反应)和调节性T细胞群(regulatory cells，Tregs；主要发挥免疫调节作用)及其分泌的相关细胞因子失去平衡引起[2]。白塞氏病(BD)是我国非常常见的一种非肉芽肿性自身免疫性葡萄膜炎，主要病理改变是闭塞性血管炎，临床上以葡萄膜炎、口腔溃疡、皮肤损害及阴部溃疡为特征。BD的发病与外周血CD4+淋巴细胞亚群存在明显的关联，研究发现BD患者外周血中Th1细胞、Th17细胞占CD4+T细胞的百分比明显升高，Tregs细胞占CD4+T细胞的百分比明显下降[3-4]。

近年来，随着对微小核糖核酸(microRNA，miRNA)研究的深入，发现miRNA在与CD4+T细胞的产生与分化相关的信号通路中起着非常重要的作用。miRNA表达关键酶Dicer酶的缺失明显影响T细胞的分化与功能，这可能意味着miRNA的异常表达与自身免疫性葡萄膜炎的发病有着不可忽视的关系[3-4]。miRNA可调控免疫系统的正常发育和生理功能，其结构和功能的异常影响免疫细胞的分化、发育及功能，并参与多种自身免疫性疾病的发生、发展[5-6]。随着二者相互作用机制的阐明及miRNA检测技术的发展，其在自身免疫性疾病中的研究已成为miRNA研究中的前沿领域之一。上述研究结果提示，异常表达的miRNA可能在BD的发病过程中发挥重要作用，但目前关于miRNA在BD中的研究较少，很多机制尚未明确。本研究以miRNA在BD中的异常表达及探索其可能的调控路径作为切入点，研究BD的发病机制，以期对其有更深入的认识，并为其防治提供新的治疗靶点及策略。

表1Realtime-PCR引物序列

基因名称双向引物序列退火温度(℃)产物长度(bp)hsa-miR-425-5pGSP:5GGGGAATGACACGATCACTC3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36065hsa-miR-34a-5pGSP:5GGGGTGGCAGTGTCTTAGC3R:5CAGTGCGTGTCGTGGAGT36064hsa-miR-34c-5pGSP:5GGGAGGCAGTGTAGTTAGC3R:5CAGTGCGTGTCGTGGAGT36066hsa-miR-129-5pGSP:5GCTTTTTGCGGTCTGG3R:5TGCGTGTCGTGGAGTC36059hsa-miR-144-3pGSP:5GGGGGGTACAGTATAGATGA3R:5CAGTGCGTGTCGTGGA36066hsa-miR-483-3pGSP:5GGGGTCACTCCTCTCCTCC3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36063hsa-miR-301a-3pGSP:5GGCGGTGCAATAGTATTGT3R:5CAGTGCGTGTCGTGGAG36065hsa-miR-454-3pGSP:5GGGGGTAGTGCAATATTGCTTA3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36066hsa-miR-224-5pGSP:5GGGGGCAAGTCACTAGTGGT3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36064hsa-miR-17-5pGSP:5GGGGCAAAGTGCTTACAGTG3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36065hsa-miR-199a-5pGSP:5GGTGCCCAGTGTTCAGAC3R:5CAGTGCGTGTCGTGGAGT36067

注：GSP表示miRNA的特异引物，R表示与GSP相匹配的引物。

1对象和方法

1.1对象选取2016-03/2017-11于我院就诊的发病期BD患者15例作为BD组，均为男性，年龄23～45岁，均符合国际公认的BD诊断标准[7]，排除其它免疫性疾病及全身其他系统疾病。选取同期于我院体检中心体检的健康人15例作为对照组，均为男性，年龄25～41岁，排除免疫性疾病及眼部疾病。本研究经本院伦理委员会审批通过，所有受检者均对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1主要试剂与设备主要试剂：Trizol LS Reagent、无RNA酶糖原(Invitrogen Life Technologies)，氯仿、异丙醇、100% 乙醇(上海化学试剂有限公司)、75%乙醇(DEPC水配制)。主要设备：Axon GenePix 4000B微阵列扫描仪(Axon Instruments，USA)、GenePix Pro 6.0软件(Axon)、洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems)。

1.2.2提取血浆清晨采取空腹肘静脉血4mL置于含有EDTA的紫色抗凝真空管，震荡混匀，室温静置1h。将血液分装至1.5mL无RNA酶EP管中，每管1000μL。3000r/min、20℃离心5min后观察无溶血，提取上清液至1.5mL无RNA酶EP管中。移液过程中注意不能吸取细胞层，保持血浆不被污染，将血浆分装后于-80℃保存。

1.2.3提取RNA分别取BD组和对照组各10例受检者的抗凝静脉血血浆样品解冻后4℃ 12000r/min离心10min，取250μL血浆转至1.5mL的离心管中，加入750μL的Trizol LS Reagent试剂混匀。匀浆后于15℃～30℃孵育5min。加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，5℃～30℃孵育3min。4℃ 12000r/min离心15min，可见混合液体分为下层的红色酚氯仿相，中间层和上层的无色水相，RNA全部于水相中。将水相转移至新离心管，并加入500μL异丙醇，混匀后15℃～30℃孵育10min，4℃ 12000r/min离心10min，可见管底部和侧壁上形成胶状沉淀块即RNA沉淀。移去上清液，加入1mL 75%乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃ 7500r/min离心5min。去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5～10min，保存于-70℃备用。

1.2.4miRNA标记和miRNA阵列杂交将提取的血浆RNA样本交由Kang Chen-Biotech(中国上海)进行miRNA标记和miRNA阵列杂交。通过Axon GenePix 4000B微阵列扫描仪扫描，GenePix Pro 6.0软件读取图像的原始强度。归一化后，将每个miRNA点获得的平均值用于统计分析，计算绿色信号与红色信号的比率。本研究筛选上调和下调的miRNA的阈值分别是倍数变化>2.00和倍数变化<0.50。通过miRTarBase数据库检索显著差异性表达的miRNA已经过验证的靶基因，并选取与免疫学相关的差异性表达的miRNA进行Real time-PCR验证。

表2miRTarBase数据库筛选出的与免疫学相关的差异性表达miRNA及其靶基因

靶基因miRNACDKN1Ahsa-miR-520b、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-654-3p、hsa-miR-17-5pMCL1hsa-miR-193-3pNotch1hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-144-3pMAP4K4hsa-miR-520eBMI1hsa-miR-300、hsa-miR-487b-3pDR1hsa-miR-513b-5pSMAD4hsa-miR-483-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-199a-5pRUNX3hsa-miR-301a-3pHLA-Ghsa-miR-152-3pDNMT1hsa-miR-152-3pJAK1hsa-miR-17-5pPTENhsa-miR-17-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-141-3pATMhsa-miR-374a-5p

表3差异性表达的miRNA的Realtime-PCR检测结果

miRNABD组(n=5)对照组(n=5)tPhsa-miR-34c-5p1.47±0.310.78±0.243.510.0079hsa-miR-129-5p0.78±0.240.92±0.28-0.770.4654hsa-miR-34a-5p1.09±0.310.83±0.251.320.2243hsa-miR-144-3p1.09±0.170.76±0.222.400.0429hsa-miR-483-3p1.62±0.280.98±0.223.580.0072hsa-miR-301a-3p0.57±0.141.03±0.19-3.930.0044hsa-miR-224-5p0.40±0.060.73±0.18-3.580.0071hsa-miR-454-3p0.58±0.111.01±0.20-3.770.0055hsa-miR-17-5p0.63±0.121.20±0.37-6.900.0203hsa-miR-199a-5p0.34±0.110.87±0.10-5.110.0001

2结果

2.1差异性表达的miRNA本研究发现，与正常对照组相比，BD组共检出具有差异性表达的miRNA 358个，其中上调miRNA 223个，下调miRNA 135个，见图1。

2.2差异性表达的miRNA靶基因生物信息学分析通过miRTarBase数据库可检索到的本研究发现的与免疫学相关的差异性表达的miRNA靶基因见表2。本研究发现的显著异常表达的miRNA靶基因主要集中在CDKN1A、Notch1、SMAD4，其中Notch1和SMAD4信号通路与免疫系统疾病的相关性较高，故选择相应的miRNA进行Real time-PCR验证。

图1差异性表达的miRNA火山图红色表示符合筛选要求的miRNA。

3讨论

BD是我国常见的致盲率较高的葡萄膜炎类型之一，患病人数约占全国葡萄膜炎患者总数的16.5%[8]，具有较高的代表性。BD的发病与外周血CD4+淋巴细胞亚群具有不可忽视的关系，BD患者外周血中Th1细胞、Th17细胞占CD4+T细胞的百分比明显升高，Tregs细胞占CD4+T细胞的百分比明显下降。随着对miRNA的深入研究，发现当miRNA表达关键酶Dicer酶缺失时，Th细胞的分化与功能会受到明显的影响，提示自身免疫性葡萄膜炎的发生可能与miRNA的异常表达有着密不可分的关系[3-4]。

miRNA是一类由基因组脱氧核糖核酸(DNA)编码的由21～25个核苷酸序列组成的单股非编码核糖核 酸(RNA)。miRNA虽小，但其可以直接作用于活细胞内的特异性目的基因信使核糖核酸(mRNA)的3’端非编码区，抑制目的基因mRNA的表达，从而抑制相应蛋白质的合成，参与调节多个生理过程。miRNA的产生主要经过原始miRNA(primary microRNA，pri-miRNA)、前体miRNA(precursor microRNA，pre-miRNA)、双体miRNA后成为成熟miRNA[5]。miRNA在动植物转录后水平参与基因表达调控，通过与靶分子mRNA碱基配对降解mRNA或阻碍其翻译发挥生物学效应[9]。miRNA在免疫细胞中广泛表达，并影响免疫反应的各个阶段[5]。多种免疫过程都受到miRNA的调控，包括粒细胞发育、T细胞和B细胞的成熟与分化、抗原递呈过程、Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)的信号级联、细胞因子的产生等[10]。循环miRNA可丰富而稳定地存在于体液中。在疾病状态下，循环miRNA的表达谱有特征性的改变，循环miRNA可作为一种无创伤性生物标志物参与疾病的诊疗过程。

图2hsa-miR-17-5p溶解曲线。

图3hsa-miR-34a-5p溶解曲线。

图4hsa-miR-34c-5p溶解曲线。

图5hsa-miR-129-5p溶解曲线。

图6hsa-miR-144-3p溶解曲线。

图7hsa-miR-199a-5p溶解曲线。

图8hsa-miR-224-5p溶解曲线。

图9hsa-miR-301a-3p溶解曲线。

图10hsa-miR-454-3p溶解曲线。

图11hsa-miR-483-3p溶解曲线。

据推测，人类基因组中约1/3以上的基因可能是miRNA的靶基因。由于信号通路的显著剂量敏感效应，其相关基因被认为是miRNA转录调控中极为理想的候选靶基因。Notch基因于1917年在果蝇中发现，因部分基因缺失可导致果蝇翅膀出现缺口(notch)而得名。哺乳动物的Notch家族包括4种受体(Notch1～4)和5种配体(DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2)，通过这些受体和配体之间的相互作用，可以将某些特定信息在相邻细胞之间进行传递[11]。Notch信号通路在免疫调控中的重要性随着研究的深入不断彰显出来，已有研究表明Notch信号通路在Th1和Th17细胞的分化中发挥着关键作用[7，12-13]。Jiao等[14]研究发现，在胶原诱导的类风湿关节炎小鼠模型中，给予γ分泌酶抑制剂(可以抑制γ分泌酶底物Notch的活性，进而影响细胞信号传导和细胞分化)的小鼠的脾和外周淋巴结Th17细胞及白细胞介素17(interleukin 17，IL-17)的数量较对照组明显减少，表明Notch信号通路对Th17细胞的发育、分化均发挥重要的调节作用。Zheng等[15]研究发现，肾移植术后不同恢复程度的患者中Notch1和DLL-4的表达量与Th17细胞水平的变化均呈明显正相关，提示在肾移植急性排斥反应中Th17细胞的增殖和分化与Notch1和DLL-4密切相关。Keerthivasan等[8]应用Notch1 siRNA阻滞剂特异性阻断Notch1信号通路，不但可以降低Th17细胞的转录因子视黄酸相关孤儿核受体γt(retinoid-related orphan receptor subfamily γt，RORγt)的 mRNA的表达，亦能显著减少极化状态下Th17细胞分泌IL-17A、IL-17F等细胞因子，提示Notch1至少可通过RORγt和IL-17基因启动子这两个位点调控Th17细胞分化和功能。Qi等[16]研究表明，活动期BD患者存在Notch1通道的异常激活，阻断Notch1信号通路能倾向性抑制Th17细胞免疫反应，而这种倾向性的抑制作用可能是通过信号传导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)的磷酸化水平来实现的。本研究结果表明，活动期BD患者血浆中hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-144-3p上调，这些miRNA的靶基因为Notch1，提示hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-144-3p的异常上调很可能参与了Notch1信号通路的异常激活。异常激活的Notch 1信号途径通过调节STAT3磷酸化或/和通过RORγt和IL-17基因启动子引起Th17细胞的增殖，促进BD的发病。

SMAD4蛋白作为序列保守的SMAD蛋白家族的一员，其主要功能是参与转化生长因子β(TGF-β)超家族细胞内信号转导。SMAD4在TGF-β超家族的信号转导途径中处于中枢地位，对恶性肿瘤的发生、发展及转移有重要影响。近年有研究表明，SMAD4通过诱导致病性Th17细胞的分化参与多发性硬化的发病过程[17]。机体发生感染时，大量产生的IL-6和TGF-β通过诱导特定基因的表达影响Th17细胞的分化过程[18]。有研究进一步表明，需要在TGF-β和IL-6这两个在宏观上有着相反功能的细胞因子的共同作用下起始Th17细胞的分化[19]。Th17细胞的分化受RORγt和RORα共同诱导。TGF-β既能够诱导RORγt表达又能够诱导Foxp3的表达，在IL-6缺乏的情况下，TGF-β诱导产生的Foxp3能够抑制细胞的进一步分化；在IL-6和TGF-β共同存在的情况下，IL-6可以通过活化Th17细胞分化中的重要调控点—STAT3，抑制Foxp3的表达并阻止其与RORγt的相互作用，使RORγt表达大幅度增加，促进Th17细胞的分化[20]。本研究结果表明，活动期BD患者血浆中hsa-miR-483-3p异常上调，hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-199a-5p异常下调，鉴于SMAD4对致病性Th17细胞的分化诱导作用，我们可以认为这些异常表达的miRNA很可能通过SMAD4参与TGF-β超家族细胞内信号转导，在IL-6 和 TGF-β共同存在的情况下，IL-6 活化STAT3，抑制Foxp3的表达并阻止其与 RORγt 的相互作用，使 RORγt表达大幅度增加，促进Th17细胞的分化，参与BD的发病。

综上所述，miRNA的异常表达可通过靶基因影响机体的免疫反应，促使疾病发生。本研究结果表明，miRNA的异常表达可能促进BD的发生及发展，免疫微环境中异常表达的miRNA所导致的BD患者免疫功能的异常可能是通过靶向Notch1和SMAD4来实现的，这两条作用通路都与STAT3和RORγt相关，提示Notch1和SMAD4信号通路可能具有很强的相关性，二者在BD的发病过程中起到协同作用。但由于本研究样本数量偏少，还需要进一步扩大样本量以验证上述结论，并进一步探讨异常表达的miRNA与Notch1和SMAD4信号通路在BD发病机制中扮演的具体角色，这也是我们未来实验研究的方向。