年龄相关性黄斑变性患者血清miR-23a和miR-34a的表达水平及临床意义

李慧俐，孙雅楠，韩新刚

0引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)是一种致盲性退行性眼底病变，可分为干性和湿性两种病理类型[1]。目前，ARMD诊断主要依靠临床症状结合眼底摄影、光学相干断层扫描和荧光素眼底血管造影检查结果，但干性ARMD临床症状不明显，早期很难诊断，且早期诊断后无有效的预防措施[2]。因此，识别潜在相关的生物标志物，对早期诊断、预防治疗，改善ARMD预后具有重要的临床意义。miRNA参与人体多种生理病理过程，近年来研究表明，miRNA在视网膜发育和病变中发挥重要调控作用[3]。有研究对ARMD患者进行循环miRNA检测，结果显示216个miRNA表达异常，多个miRNA显示出潜在的诊断价值[4]。研究表明，ARMD患者血清miR-23a和miR-34a表达异常，可能在ARMD发展中发挥调控作用[5]。因此，本研究探讨miR-23a和miR-34a在ARMD患者血清中的表达水平，分析其在ARMD发病中的可能调控途径及临床诊断意义，以期为ARMD早期诊断和治疗提供理论参考。

1对象和方法

1.1对象选取2015-05/2018-02在我院诊治的ARMD患者102例为研究对象(病例组)，其中男52例，女50例；年龄53～75(平均62.58±9.32)岁；根据美国国家眼科研究所关于ARMD的分期标准[6]：早期34例，中期38例，晚期30例。另选取同期于我院体检健康者70例作为对照组，其中男36例，女34例；年龄50～80(平均61.73±11.42)岁。纳入标准：(1)ARMD患者均符合《年龄相关性黄斑变性诊断指南》中的诊断标准[7]；(2)对照组受检者眼底检查等各项身体指标正常，且无眼部疾病家族史。排除标准：(1)合并高血压、糖尿病及心脑血管疾病者；(2)合并恶性肿瘤及感染性疾病者；(3)合并肝、肾功能损伤及结缔组织病变者；(4)视力正常的年龄相关性玻璃膜疣、脉络膜黑色素瘤及中心性渗出性脉络膜炎患者；(5)合并免疫性、代谢性相关疾病及其它全身疾病者。病例组和对照组受检者性别、年龄等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，病例组不同分期组患者一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，所有受检者均知情并自愿参与本研究。

1.2方法

1.2.1血样采集病例组患者于确诊后次日清晨采集空腹肘静脉血5mL，对照组受检者于体检当日采集空腹肘静脉血5mL，采集血样于4℃条件下，离心10min，分离血清保存于超低温冰箱中。

1.2.2miR-23a和miR-34a检测采用Trizol裂解液(Invitrogen公司)提取血清总RNA，逆转录合成cDNA,以cDNA为模板，进行RT-PCR检测(SuperScriptTMⅢ一步法RT-PCR系统和SYBR@Green实时PCR预混液均购于赛默飞世尔科技有限公司)。RT-PCR反应条件：93℃预变性30s；93℃变性30s，58℃/60℃退火30s，72℃延长30s，共40个循环；72℃延长10min。引物序列：miR-23a正向5’-CAGGCGGGTAGTAGATG-3’，反向5’-AGGGACGGGCATGGAAAGG-3’；miR-34a正向5’-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3’，反向5’-GCCATTCAGGCTAGCAGC-3’；U6内参正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。 引物均合成于上海生工生物工程有限公司。采用2-△△Ct法计算miR-23a和miR-34a相对表达量。

分期例数miR-23a相对表达量miR-34a相对表达量早期341.22±0.281.83±0.37中期381.43±0.36b2.04±0.48b晚期301.81±0.51b,d2.35±0.59b,d F18.7509.278P<0.01<0.01

注：bP<0.01vs早期；dP<0.01vs中期。

1.2.3TNF-α和NF-κB检测采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)检测两组受检者血清TNF-α和NF-κB水平，具体操作方法严格参照说明书进行。本研究所使用人TNF-α ELISA检测试剂盒(双抗体夹心法)和NF-κB检测试剂盒(ELISA法)均购于上海江莱生物科技有限公司。

统计学分析：本研究采用统计学软件SPSS22.0分析数据。血清因子表达水平等计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用独立样本t检验。血清miR-23a、miR-34a与TNF-α、NF-κB的相关性分析采用Pearson相关分析法。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic，ROC)分析血清miR-23a和miR-34a对ARMD的诊断价值。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1两组受检者血清miR-23a和miR-34a表达水平病例组患者血清miR-23a和miR-34a相对表达量(1.47±0.36和2.06±0.54)均高于对照组(0.61±0.18和0.83±0.22)，差异均有统计学意义(t=18.455、18.044，均P<0.01)，见图1。

2.2病例组不同分期患者血清miR-23a和miR-34a表达水平病例组不同分期患者血清miR-23a和miR-34a相对表达量比较差异均有统计学意义(P<0.01)，且晚期患者血清miR-23a和miR-34a相对表达量显著高于中期和早期患者，中期患者血清miR-23a和miR-34a相对表达量显著高于早期患者，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1，图2。

2.3两组受检者血清TNF-α和NF-κB水平病例组患者血清TNF-α和NF-κB水平(135.62±34.57pg/mL和613.91±102.33ng/L)均高于对照组(65.98±15.83pg/mL和214.35±51.86ng/L)，差异均有统计学意义(t=15.748、7.727，均P<0.01)。

图1两组受检者血清miR-23a和miR-34a相对表达量比较A：两组受检者血清miR-23a相对表达量；B：两组受检者血清miR-34a相对表达量。bP<0.01vs对照组。

图2病例组不同分期患者血清miR-23a和miR-34a相对表达量比较A：病例组不同分期患者血清miR-23a相对表达量；B：病例组不同分期患者血清miR-34a相对表达量。bP<0.01vs早期；dP<0.01vs中期。

图3病例组患者血清miR-23a、miR-34a与TNF-α、NF-κB的相关性分析A：血清miR-23a相对表达量与TNF-α水平的相关性；B：血清miR-23a相对表达量与NF-κB水平的相关性；C：血清miR-34a相对表达量与TNF-α水平的相关性；D：血清miR-34a相对表达量与NF-κB水平的相关性。

图4血清miR-23a和miR-34a诊断ARMD的ROC曲线分析。

2.4病例组患者血清miR-23a、miR-34a与TNF-α、NF-κB的关系病例组患者血清miR-23a相对表达水平与TNF-α、NF-κB水平均呈显著正相关关系(r=0.798、0.720，均P<0.01)；血清miR-34a表达水平与TNF-α、NF-κB水平均呈显著正相关关系(r=0.814、0.740，均P<0.01)，见图3。

2.5血清miR-23a和miR-34a对ARMD的诊断价值分析血清miR-23a诊断ARMD的ROC曲线下面积(AUC)为0.831(0.767～0.884)，诊断敏感性为75.49%，特异性为77.14%；血清miR-34a诊断ARMD的ROC曲线下面积(AUC)为0.867(0.807～0.914)，诊断敏感性为79.41%，特异性为78.57%，见图4。

3讨论

ARMD主要发生于45岁以上人群，患病率随年龄增长而增加，已成为目前老年人视力慢性不可逆性损伤及致盲的重要眼病之一[8]。流行病学研究表明，心脑血管疾病、慢性肾病、糖尿病及遗传、衰老等是ARMD的危险因素[9]。ARMD主要临床特点为进行性色素上皮萎缩和脉络膜新生血管形成及其引发的一系列病理改变，其发病过程复杂，涉及多种因素，但具体发病机制尚不完全清楚，多认为与免疫炎症、氧化损伤、遗传及基因突变等密切相关[10]。近年多项研究表明，ARMD患者存在不同程度氧化应激和炎症反应，与病变严重程度有关，但介导氧化应激和炎症反应发生的相关因子及途径尚不明确。ARMD病理相关研究表明，其病变组织中存在大量巨噬细胞，通过分泌炎性因子，参与脉络膜新生血管形成及纤维血管组织增生过程[11]。

色素上皮细胞能够消化、吞噬坏死、脱落的感光细胞，维持视网膜内环境稳定，但这个过程中会产生大量脂肪醛自由基和氧自由基，同时色素细胞受强光照射也会诱导氧自由基产生，大量氧自由基在眼底堆积可最终导致色素上皮细胞功能损伤及视网膜氧化损伤[12]。现已证实炎症反应和氧化应激是ARMD的重要病理机制。研究表明，miRNA与色素上皮细胞氧化应激密切相关，如miR-184在维持色素上皮细胞正常吞噬功能中发挥重要调控作用[13]。此外，miRNA还与ARMD脉络膜新生血管形成、免疫炎症反应有关[14]。 miR-23a是miR-23亚型之一，其在细胞分化、凋亡及炎症反应、心脏病变中扮演重要角色[15]。Li等[16]研究表明，H2O2诱导色素上皮细胞凋亡时miR-23a表达上调，并可明显增加色素上皮细胞对H2O2的敏感性，而抑制miR-23a表达则能够抑制H2O2诱导的色素上皮细胞死亡，提示 miR-23a能够促进氧化应激反应，促进人视网膜色素上皮细胞凋亡。本研究结果显示，与正常者相比，miR-23a和miR-34a在ARMD患者血清中表达明显上调，且血清miR-23a和miR-34a相对表达量在不同分期患者中呈逐渐升高趋势。视网膜色素上皮细胞形成血-眼屏障，而TNF-α是破坏其屏障功能和血管生成的主要炎性细胞因子，通过p38 MAPK途径在ARMD病理过程中发挥作用[17]。为探究血清miR-23a和miR-34a表达异常与ARMD氧化应激和炎性反应水平的关系，本研究检测ARMD患者血清TNF-α和NF-κB水平，与正常者相比，ARMD患者血清TNF-α和NF-κB水平均显著升高，相关性分析显示，ARMD患者血清miR-23a和miR-34a分别与TNF-α和NF-κB呈正相关关系，表明血清miR-23a和miR-34a表达上调与氧化应激和炎症反应有关。

衰老的主要特征包括线粒体功能失调、氧化应激、慢性低度炎症及细胞凋亡率增加等。Rippo等[18]研究表明，miR-34a、miR-146a等miRNA在ARMD患者血清中过度表达，其靶向Bcl-2基因在细胞生长、凋亡和年龄相关疾病中发挥重要作用，其调节作用可以介导衰老细胞中线粒体完整性和功能丧失，诱导或促进炎症反应和与年龄有关的疾病。Bhattacharjee等[19]研究发现，miR-34a通过介导小胶质富集触发受体的下调，调节吞噬反应，在ARMD氧化应激反应中发挥重要作用。本研究发现，miR-23a和miR-34a分别与TNF-α和NF-κB呈正相关关系，推测血清miR-23a和miR-34a表达升高可促进机体炎症因子TNF-α的释放，激活NF-κB途径，通过介导炎症反应和氧化应激在ARMD发病过程中发挥促进作用。光学相干断层扫描和荧光素眼底血管造影大大提高了ARMD早期诊断效率，在ARMD诊断中各具优势，但由于部分患者早期临床症状不明显或无症状，导致上述检查存在一定的局限性。本研究采用ROC曲线分析显示，血清miR-23a诊断ARMD的ROC曲线下面积(AUC)为0.831，诊断敏感性为75.49%，特异性为77.14%；血清miR-34a诊断ARMD的ROC曲线下面积(AUC)为0.867，诊断敏感性为79.41%，特异性为78.57%。表明血清miR-23a和miR-34a对ARMD具有一定诊断价值。

综上所述，ARMD患者血清miR-23a和miR-34a表达上调，可能通过促进炎性因子分泌，激活氧化应激反应，促进ARMD发生、发展，推测抑制miR-23a和miR-34a表达能够降低炎症和氧化应激反应，缓解病情，提高治疗疗效，但其是否是ARMD治疗新靶点及其治疗效果仍有待进一步深入研究。早期诊断对ARMD预防治疗和改善预后至关重要，检测血清miR-23a和miR-34a水平有助于早期辅助诊断，对早期干预治疗具有一定的临床指导意义。