我国东北地区格子状角膜营养不良家系的TGFBI基因突变研究

胡 莹，刘 驰

0引言

格子状角膜营养不良(lattice corneal dysprothy，LCD)是一种常染色体显性遗传病，是角膜基质层营养不良，以双侧角膜基质层折光格子线条的淀粉样沉积物为特征[1]，可以发生在任何年龄。其分为四种类型LCDⅠ、LCDⅡ、LCDⅢ和LCDⅢA型，还有一种兼具LCDⅠ的某些特征和LCDⅢ或LCDⅢA的一些特征，由于不能归属于任何一型，因此在2002年法国学者Schmitt-Bernard等建议将其定义为中间型LCD即LCDi(intermedium)型[2-3]。其中最常见的是LCDⅠ。目前报道的LCDⅠ的基因突变，除伴有全身淀粉样变性的LCDⅡ型(又称Meretoja综合征)为9号染色体Gelsolin基因突变外，其余均为位于染色体5q31上的TGFBI基因(transforming growth factor β-induced gene)，TGFBI基因也是第一个被确定的角膜营养不良的致病基因[4]。它包含17个外显子，其中第4、11、12、13、14外显子被认为是突变热点[5]。我们对我国东北地区一家系中家族性LCDⅠ患者的TGFBI基因进行突变检测，了解我国东北地区家族性LCD的临床表型和突变类型。

1对象和方法

1.1对象于2017-02选取来自中国东北地区同一家系的2名正常者(Ⅱ∶3和Ⅲ∶2)和3例患者(Ⅲ∶1、Ⅲ∶4、Ⅲ∶5，图1)为研究对象。对该家族所有参与者进行裂隙灯检查，以确定是否受到角膜营养不良影响或不受影响，并确定疾病表型。获得所有参与对象的详细临床病史，例如发病年龄、初始体征和症状、疾病进展、其他眼部治疗过程等。从沈阳市第四人民医院体检中心招募了50名健康人作为对照组，无相关视力障碍的病史。该家系成员为汉族，无近亲联姻史，长期居住辽宁省。本研究已经取得沈阳市第四人民医院伦理委员会批准，在研究之前获得所有受试者书面知情同意书。本研究中的所有程序都遵循赫尔辛基宣言的原则。

1.2方法

1.2.1DNA提取取外周静脉血2mL，置于真空采血管中，4℃冰箱保存，1wk内应用血液基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。

1.2.2聚合酶链反应采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)分别对TGFBI基因的外显子进行扩增。特异性引物均由上海生工生物公司合成，引物序列见表1。PCR体系：ddH2O 37.4μL，10×Buffer 5μL，dNTP 2μL，引物F 2μL，引物R 2μL，DNA模板2μL，LA Taq酶0.4μL。PCR循环条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s(不同引物退火温度不同，表1)，72℃延伸45s共30个循环，最后72℃总延伸7min。PCR产物检测：用2%琼脂糖电泳，取PCR扩增产物3μL与1μL甘油溴酚蓝加样液混合均匀后加入凝胶上样孔中，进行95V恒压电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE。暗箱式紫外投射仪中成像检测，保存图片。

1.2.3PCR产物直接测序将PCR产物和引物送华大基因生物技术有限公司进行纯化，并进行测序。将其结果与GenBank中的原始序列进行Blast比对，并对所得到的序列图谱进行分析，以确定是否存在基因突变。

2结果

2.1临床检测结果通过眼科检查和追问家族史确定了该家系中有6例患者，其中3例患者(Ⅲ∶1、Ⅲ∶4、Ⅲ∶5)参与本研究。受影响的LCDⅠ受试者表现出类似的临床特征，除了患者Ⅲ∶5呈现轻度症状。该家族中的先证者(Ⅲ∶1)和患者Ⅲ∶4曾就诊于我院，最初被诊断为LCDⅠ。先证者自35岁以来经历了双侧反复发作性眼红、疼痛、畏光、异物感、流泪等角膜刺激症状，并且在过去的10a中双侧视力进行性恶化。裂隙灯检查显示中央角膜表面基质伴有上皮侵蚀中的各种不同线性沉积物(图2)。在具有LCDⅠ的该家庭中鉴定出TGFBI基因中的R124C突变。也发现患者在大约21～25岁时开始表现出轻微的异物感，并表现出明显的视力下降。

2.2分子遗传学检测结果该家系中患者的测序结果均发现TGFBI基因第4外显子370位点碱基C>T的改变，蛋白质由编码精氨酸的CGC突变为编码半胱氨酸的TGC，即发生了R124C突变，为杂合子(图3)。家系中的正常成员(Ⅱ∶3和Ⅲ∶2)和正常对照组均未发生TGFBI基因突变。

2.3生物信息学分析结果应用Polyphen-2软件分析突变蛋白的各物种间的保守性结果显示(图4)，该突变氨基酸在各物种间高度保守，并且该突变具有致病性。

3讨论

LCDⅠ是一种常染色体显性遗传性角膜淀粉样变性病，伴有严重的视觉缺陷，TGFBI基因突变是LCDⅠ发病的主要原因。本研究中，在一个中国东北地区LCDⅠ家系中检测到TGFBI基因的杂合突变c.370C>T(p.R124C)。近年来研究发现，TGFBI基因的突变至少与5种类型遗传性角膜营养不良的发病相关。在所报道的突变中，TGFBI基因中的R124似乎是全世界各种族群不同类型角膜营养不良中检测到的“热点”点突变[6]。同时，研究也发现TGFBI基因的第4外显子中的R124在许多不同物种中高度保守(图4)，表明该残基是蛋白质的重要功能和结构位点。因此，研究该疾病的基因突变并鉴定发病家族的临床特征和表型-基因型相关性非常重要。

表1TGFBI基因第4、11、12、13、14外显子的引物序列和PCR扩增条件

外显子引物序列退火温度(℃)片段长度(bp)4FCTGTCAGAGAAGGGAGGGTGG592964RCGGGGAAGTAAGGCAGATC11FTGACCCTGCTAATGCTCTG6027711RCCAGCATGACCAACTGGG12FAAAATACCTCTCAGCGGGTG5827012RGCCCTGAGGGATCACTACTTAG13FCCAGGCTAATTACCATTCTG6025013RTGAGATATGTCCTGGAGCC14FGGCGACAAGATTGAACTCC5923014RTCTTCTCTCCACCAACGCC

图1格子状角膜营养不良家系图谱。

伴有相同突变甚至在同一家族中的角膜营养不良患者的表型变异潜在机制需要进一步研究。因此，虽然已经有LCDⅠ家系中R124C突变的表型变异的研究[7]，本研究中还要对该家族中被诊断为LCDⅠ的3例患者进行基因突变分析，以评估遗传异质性。在本研究中，具有R124C突变的患者表现出与LCDⅠ类似的临床特征。虽然患者Ⅲ∶5表现出轻微的症状，但它们都具有细微线性混浊，主要位于角膜基质并伴有上皮侵蚀。分子遗传学分析对确定角膜营养不良的分类很重要，揭示可靠的临床诊断标准，提高临床诊断的准确性。尽管患者Ⅲ∶5没有表现出LCDⅠ的典型临床特征，但是与其他2例患者携带相同的R124C突变，因此被诊断为LCDⅠ。这表明遗传分析可能用于产前和产后DNA诊断。在裂隙灯检查受影响的家庭成员时，发现他们的角膜上皮均被侵蚀，表现为畏光和流泪。有学者观察发现角膜营养不良的患者Bowman膜异常形态，发现神经纤维密度明显减少甚至消失；损伤的Bowman膜很可能不能为角膜神经生长提供营养，从而导致角膜沉积。如果这种角膜营养不良是由于缺乏营养，这种疾病可能用神经营养因子治疗。TGFBI蛋白涉及各种细胞类型的细胞黏附和迁移，包括上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞[8]。因此，患有TGFBI R124C突变的患者可能表现出角膜上皮细胞与整个上皮层之间连接的松弛，导致该家族中角膜基质营养不良。此外，神经纤维不能长入Bowman层导致角膜上皮细胞缺乏神经营养，导致角膜上皮脱落(图2)。

图2先证者和Ⅲ∶5患者的角膜裂隙灯显微镜照片A：先证者的角膜上皮混浊，基质层中典型的格子状线条；B：先证者的角膜上皮荧光素染色显示上皮缺损；C：Ⅲ∶5 患者(17岁)，角膜上片小片缺损，基质层中单个的格子状线条。

图3分子遗传学检测结果A：家系中患者TGFBI基因4号外显子第370个碱基呈杂合性点突变C→T，导致编码该密码子的精氨酸变成半胱氨酸；B：正常的4号外显子序列。

图4Polyphen-2软件分析结果，该突变氨基酸在各物种间高度保守，并且该突变具有致病性。

总之，在具有LCDⅠ的中国东北地区家庭中鉴定了TGFBI基因的突变。目前的研究结果表明了LCDⅠ的临床特征，并在该家族中揭示了明确的基因型相关表型，这可能有助于进一步理解TGFBI基因突变在LCDⅠ发展中的作用。然而，患者角膜层的组成仍然未知，因此其具体的潜在机制需要进一步研究，且需要未来的功能性研究以确认TGFBI基因的作用和疾病发生的潜在机制。