外泌体在胰腺癌诊治中的研究进展

张驰综述，任庆兰审校

0 引言

胰腺癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤。绝大部分胰腺癌患者确诊时已是晚期，其中不能手术切除和发生远处转移的分别占27%和53%[1]。故胰腺癌的早期诊断和治疗显得尤为重要。近期研究表明，外泌体能够促进胰腺癌细胞增殖、新生血管生成及转移前微环境形成，介导机体免疫抑制，参与化疗耐药性形成等。本文将对外泌体在胰腺癌的发生发展、诊断、治疗及预后等方面的研究进展进行综述，旨在为胰腺癌早期诊治提供新思路。

1 外泌体的概述

1.1 生物学特性

外泌体在1983年被首次报道，4年后研究者运用离心分离法从羊网织红细胞中分离出具有一定生物学活性的囊泡状结构并正式命名为“外泌体”。目前研究表明，外泌体是直径为30～100 nm的来源于核内体的一种细胞外囊泡结构，包含核酸、蛋白质等多种活性成分，通过传递内部的活性成分参与细胞间通讯从而发挥多种生物学作用[2]。各种生理或病理状态下，外泌体可由造血细胞、血小板、神经元细胞、免疫细胞、上皮细胞、间充质细胞及肿瘤细胞等不同类型细胞合成分泌，在血浆、尿液、唾液、恶性胸腹腔积液等体液中广泛分布[3-4]。外泌体形成过程：首先通过细胞内吞产生早期核内体，随后核内体膜向内凹陷在其内部形成许多小囊泡，称为晚期核内体或多囊泡体，最后，多囊泡体与胞膜融合将管腔内的核内体小囊泡释放到胞外形成外泌体[5]。外泌体通过介导细胞信号转导、调节细胞稳态、影响机体免疫应答、参与炎性反应和凝固反应等方式影响多种生理病理过程，对研究肿瘤、神经退行性变、感染和自身免疫性疾病等多种疾病的发生发展、诊断、治疗具有重要价值[6-7]。

1.2 组成成分

外泌体由蛋白质、核酸和脂质构成，据外泌体内容物数据库官网（www.exocarta.org）最新统计，在不同组织及细胞来源的外泌体中存在有41 860种蛋白质、4 946种mRNA和1 116种脂质。几乎所有外泌体有如下蛋白质[8]：（1）细胞骨架蛋白，如肌动蛋白；（2）与多囊泡体生物起源相关的蛋白质，如肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）；（3）膜转运及融合蛋白，包括膜联蛋白、Rab蛋白；（4）四次跨膜蛋白超家族，如CD9、CD63、CD81。外泌体包含不同种类的核酸，如双链DNA（dsDNA）、单链DNA（ssDNA）、线粒体DNA（MtDNA）、信使RNA（mRNA）、微小RNA（microRNA）、核小RNA（snRNA）、非编码RNA（ncRNA）和小细胞质RNA（small cytoplasmic RNA）等[9]。外泌体还含有丰富的脂质，包括胆固醇、甘油二酯、鞘磷脂、神经酰胺、磷脂酰丝氨酸等。其外膜由富含胆固醇、鞘磷脂和神经酰胺的脂质双分子层组成，具有较高的稳定性，使其内部活性物质免受降解[10]。

2 外泌体与胰腺癌

2.1 外泌体促进胰腺癌细胞增殖及新生血管形成

Takikawa等[11]报道胰腺星状细胞活化产生的miR-21-5p阳性的外泌体能显著促进胰腺癌细胞增殖、迁移。磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（glypican 1,GPC1）是肿瘤源性外泌体内的一种蛋白多糖，Whipple等[12]通过动物实验发现GPC1阳性组的胰腺癌细胞增殖速率和新生血管形成速率均显著高于GPC1阴性组，提示GPC1阳性的外泌体能促进胰腺癌细胞增殖及新生血管形成。另有研究表明，胰腺癌细胞可分泌富含miR-1246和miR-1290的外泌体，高表达的miR-1290通过增加胰腺星状细胞中平滑肌肌动蛋白及纤维化相关基因表达促进胰腺癌细胞增殖和细胞间质增生[13]。

2.2 外泌体促进胰腺癌侵袭及远处转移

Costa-Silva等[14]发现，胰腺癌分泌的外泌体中的巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）通过激活纤维化信号通路使肝脏星状细胞产生大量纤连蛋白并募集大量巨噬细胞及中性粒细胞促进转移前微环境形成，介导胰腺癌肝转移。有报道称胰腺癌细胞可产生环状RNA IARS（Circular RNA IARS, Circ-IARS）阳性的外泌体，Circ-IARS过表达使miR-122、ZO-1表达下调，RhoA、F-actin表达上调，并增加血管内皮细胞通透性，促进胰腺癌侵袭及远处转移[15]。Wang等[16]发现低氧情况下胰腺癌外泌体中的miR-301a-3p通过刺激PTEN/PI3Kγ信号途径诱导巨噬细胞向M2亚型转化促进胰腺癌的迁移、侵袭及远处转移，且外泌体miR-301a-3p水平与胰腺癌的侵袭深度，淋巴结转移，晚期TNM阶段和不良预后呈正相关。

2.3 外泌体可介导机体免疫抑制

肿瘤源性外泌体通过抑制免疫细胞生长、分化、成熟或通过调节相关细胞因子表达水平影响细胞信号转导通路从而抑制机体免疫功能。Javeed等[17]发现胰腺癌分泌的外泌体通过诱导精氨酸酶和活性氧表达、影响STAT3信号通路使正常单核细胞转变为具有免疫抑制作用的单核细胞，抑制机体免疫功能。Zhou等[18]研究指出胰腺癌外泌体中高表达的miR-203通过下调肿瘤坏死因子α（TNFα）、toll样受体4（TLR4）、白细胞介素12（IL-12）等细胞因子表达水平抑制树突状细胞的抗原提呈及激活作用，从而干扰抗肿瘤免疫应答。肿瘤源性外泌体通过干扰白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子β（TNFβ）等细胞因子相关的免疫活化通路引起免疫抑制，还可激活FasL途径、半乳糖凝集素9途径诱导肿瘤细胞周围的免疫细胞凋亡[19]。

2.4 外泌体介导胰腺癌化疗耐药形成

Patel等[20]研究证实暴露于吉西他滨的胰腺癌细胞分泌的外泌体能介导化疗耐药形成，基因分析提示胰腺癌耐药细胞中SOD2、CAT基因（用于编码活性氧物质降解酶的基因）表达上调，而DCK基因（用于编码吉西他滨代谢酶的基因）表达下调，当miR-155功能抑制或者DCK表达恢复可解除胰腺癌细胞获得性耐药。另有研究发现肿瘤相关巨噬细胞分泌的外泌体通过传递miR-365到胰腺导管腺癌细胞内使胞苷脱氨酶表达增加，后者可使吉西他滨代谢失活，诱导胰腺癌化疗耐药形成[21]。

2.5 外泌体在胰腺癌诊断中的价值

目前针对胰腺癌常规的检查手段主要包括CT、MRI等影像学检查及CA19-9等肿瘤标志物检测，其对早期胰腺癌诊断效果欠佳，大部分患者确诊时已是中晚期，寻找准确、敏感的胰腺癌早期检测手段是胰腺癌诊疗的重中之重。

美国安德森癌症中心一项研究证实，早期胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）患者血清中的GPC1阳性的循环外泌体（GPC1+crExos）水平显著高于无病人群或慢性胰腺炎患者，行肿瘤切除术后的患者体内GPC1+crExos水平显著下降，其特异性及敏感度均优于目前常用的CA19-9，可将胰腺癌患者与胰腺良性病变及无病人群有效区分开[22]。该研究还发现，与MRI等传统影像学检查相比，GPC1+crExos敏感度更高，假阳性率更低。且GPC1+crExos水平增高与肿瘤大小和肿瘤负荷呈正相关。因此研究者认为GPC1+crExos可作为一种可靠的胰腺癌早期诊断标志物。

Lai等[23]发现PDAC患者的外泌体miR-l0b、miR-21、miR-30c和miR-181a呈高表达，而miR-let7a呈低表达，将上述外泌体miRNA进行联合检测可将胰腺癌患者与正常人和慢性胰腺炎患者区别开，其在胰腺癌早期诊断方面优于CA19-9和GPC1。Sharma等[24]实验证实磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）阳性的外泌体水平在影像学能够检测到胰腺癌变前已发生显著增高，提示其可作为潜在的胰腺癌早期诊断标志物。有中国学者发现高表达的miR-23b-3p可促进胰腺癌细胞侵袭、扩散及远处转移，其在胰腺癌患者血清中的含量显著高于正常受试者及慢性胰腺炎患者，差异具有统计学意义[25]。有研究表明，胰腺癌患者血清中外泌体miR-191、miR-21、miR-451a水平与对照组相比显著增高，统计学分析提示三种外泌体miRNA联合检测在诊断准确度和曲线下面积均优于外泌体miRNA单项检测[26]。

2.6 外泌体在胰腺癌治疗中的价值

外泌体可由机体绝大多数细胞合成分泌，可携带蛋白质、DNA、RNA等物质进入细胞内，可作为肿瘤治疗药物的理想载体，被认为是抗肿瘤治疗的重要工具。KRAS基因突变常见于胰腺癌、肺癌、结肠癌等多种肿瘤，为PDAC患者中最常见的突变类型，在PDAC患者中突变率约为88%～100%[27]。Kamerkar等[28]利用经修饰的外泌体（iExosomes）作为载体，装载针对KRAS基因的特异性的靶向物质—siRNA、shRNA，siRNA和shRNA以kRasG12D基因为靶点能显著抑制KRAS突变基因表达。将载有siRNA及shRNA的iExosomes注入胰腺癌小鼠体内发现其能显著抑制胰腺癌细胞增殖及远处转移，并提高胰腺癌小鼠总生存率。Sun等[29]研究发现胰腺癌组织与正常胰腺组织相比MiR-506水平显著降低，当胰腺癌组织中MiR-506水平增高时可直接靶向激活STAT3-BCL2-BECN1轴诱导胰腺癌细胞自噬凋亡，抑制肿瘤生长和远处转移，运用外泌体作为载体靶向运送miR-506至胰腺癌细胞中有望为胰腺癌治疗带来新的曙光。

吉西他滨作为胰腺癌标准化疗药物，在胰腺癌患者中耐药率较高，近期研究表明外泌体在介导胰腺癌化疗耐药形成中扮演关键角色，研究其具体的耐药机制能为胰腺癌患者提供新的治疗手段。Richards等[30]发现癌相关成纤维细胞（Cancerassociated fibroblasts, CAFs）对吉西他滨具有天然耐药性，CAFs在吉西他滨作用下通过释放microRNA-146阳性外泌体作用于胰腺癌细胞诱导化疗耐药形成，当加入GW4869（一种外泌体释放抑制剂）抑制CAFs外泌体释放后，胰腺癌细胞存活率显著降低。Mikamori等[31]研究证实暴露于吉西他滨的PDAC细胞miR-155表达增加，能诱导PDAC细胞化疗耐药形成，获得性耐药的PDAC细胞通过释放miR-155阳性外泌体介导周围PDAC细胞化疗耐药形成，该研究为胰腺癌治疗提供了新靶点。Aspe等[32]实验发现载有生存素T34A（Survivin-T34A）的外泌体与吉西他滨联合使用可显著促进胰腺癌细胞凋亡，并增加吉西他滨化疗敏感度。

2.7 外泌体在胰腺癌预后判断中的价值

近期安德森癌症中心学者[33]通过检测胰腺癌患者血清中的外泌体DNA（exoDNA）和循环肿瘤细胞DNA（ctDNA）水平发现：在34例潜在可切除的肿瘤患者中，新辅助治疗后exoDNA水平的增加与疾病进展显著相关，而ctDNA未显示与胰腺癌预后的相关性；在多变量分析中exoDNA中突变等位基因片段（MAFs）≥5%是无进展生存期、总生存期的显著预测因子；纵向分析中exoDNA中MAF峰值高于1%与影像学进展显著相关。Takahasi等[34]研究证实miR-451a阳性外泌体在术后复发的PDAC患者中显著增高，miR-451a高表达提示更短的总生存期和无病生存期，可作为PDAC患者一个重要的独立预后因素。有研究报道外泌体中的环状RNA PDE8A（circ-PDE8A）通过激活MACC/MET/ERK或AKT信号通路促进胰腺癌侵袭性生长，外泌体中circ-PDE8A高表达提示胰腺癌患者病情进展和预后不良[35]。

3 总结及展望

外泌体是一种分布广泛的细胞多囊泡体，通过传递其内容物调控靶细胞的信号转导通路和基因表达，从而激活或抑制相应生理和病理过程。外泌体能促进肿瘤细胞增殖、远处转移和化疗耐药性形成，介导机体免疫抑制，在胰腺癌发生发展过程中发挥关键作用，为胰腺癌的早期诊治提供了新思路。但目前相关临床研究样本量较小，外泌体用于胰腺癌诊断和治疗的机制有待进一步探索，临床应用存在较大限制。随着相关研究不断深入，外泌体有望为胰腺癌患者的早期诊治带来新的曙光。