铜绿假单胞菌群体感应系统抗菌增效机制研究进展

饶 媚， 张素平， 史道华

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是引起医院感染的主要病原菌之一，对多种抗感染药物呈固有或获得性多药耐药，常导致治疗失败，严重威胁人类健康。研发新型、安全、有效的抗菌药物或引入能中和或阻断细菌毒素产生、调控群体感应药物，疫苗，联用抗菌增效剂等非抗生素类药物辅助抗感染，一直备受关注[1]。铜绿假单胞菌耐药机制包括过表达外排泵、群体感应、产生修饰酶或灭活酶、外膜孔蛋白缺失、外膜低通透性等[2]。有研究认为群体感应系统（quorum sensing system，QSS）在铜绿假单胞菌耐药中起着极其重要的作用[3]，本文就QSS抗菌增效机制的研究进展做一综述，为靶向铜绿假单胞菌群体感应的治疗及药物研发提供新的思路。

1 QSS

QSS是细菌通过感应细胞外自身产生的分子进而对生物学功能进行调控的系统。研究表明QSS调控铜绿假单胞菌约4%～6%基因表达。铜绿假单胞菌的QSS包括以N-3-氧代十二烷酰-高丝氨酸内酯（N-oxododecanoyl-homoserin，3-O-C12-HSL）为自诱导物的LasI/LasR信号系统、las基因编码产生3-O-C12-HSL合成酶lasI，当细菌达到阈浓度时，结合到转录子lasR上，调控弹性蛋白酶、蛋白水解酶、外毒素等毒力因子表达；以N-丁酰基-高丝氨酸内酯（N-butanoyl-homoserine lactone，C4-HSL）为自诱导物的RhlR信号系统，rhl基因编码产生C4-HSL合成酶RhlI，调控鼠李糖脂的表达，同时也影响LasI/LasR部分调节子的表达；以2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮为自诱导物的喹诺酮信号分子（pseudomonas quinolone signal，PQS），当胞外PQS达阈浓度后，可启动胞内PQS与受体结合并调控绿脓菌素（pyocyanin，PCN）的产生。三个系统之间相互关联与调控，其中LasI/LasR处于上游，激活其他两个系统，RhI/RhlR对PQS负调控，PQS则起到连接LasI/LasR和RhI/RhlR两个信号系统的作用[4-5]。

QSS与铜绿假单胞菌致病性和耐药性密切相关，铜绿假单胞菌感染机体后，定植细胞通过直接扩散、受体识别等方式与3-O-C12-HSL等信号分子结合，诱导产生细胞因子，进而调节免疫应答，提高自身生存能力[6-7]。铜绿假单胞菌黏附于机体表面后通过分泌多糖基质、纤维蛋白和脂质蛋白形成致密生物膜（bio film），QSS调控生物膜黏附、群聚、形成等生物学行为从而显著增加耐药性[8-9]。此外，铜绿假单胞菌具有独特外排泵，过表达主动外排系统是铜绿假单胞菌耐药的主要机制之一。QSS与铜绿假单胞菌外排泵系统相关基因之间的相互调控同样备受关注。

2 群体感应抑制剂（quorum sensing inhibitors，QSI）

与传统抗菌药物抗菌机制不同，QSI对细菌无选择性压力，较少发生耐药，有望增强抗菌作用效果，缓解铜绿假单胞菌耐药。呋喃酮是最早发现的具有QSI作用的天然化合物，其结构修饰产物C-30对铜绿假单胞菌的QSS具有显著抑制作用，能协同抗菌药物清除小鼠肺部感染[10]。目前发现的QSI种类越来越多，按其来源可分为植物来源、人工合成或提取以及临床已用的药物。

2.1 植物来源的QQSSII

香豆素是从植物中提取的酚类化合物，具有较强的抗感染和抗肿瘤活性，能抑制不同临床分离铜绿假单胞菌菌株生物膜形成，调控QSS相关信号通路降低毒力因子表达，调控pqsABCDE和ambBCDE操纵子抑制QSS相关基因lasI、rhlI、rhlR的表达。环二鸟苷酸（C-di-GMP）是细菌第二信使分子，调节细菌细胞分化、生物膜形成、毒力因子产生等多种生物学行为，并受到二鸟苷酸环化酶（DGC）和磷酸二酯酶（PDE）调控，胞内高浓度C-di-GMP可促进铜绿假单胞菌的生物膜形成，研究表明香豆素正向调节tpbA从而显著降低C-di-GMP水平[8]。

迷迭香酸（rosmarinic acid）是从唇形科植物迷迭香中分离得到的水溶性天然酚酸类化合物，是一种天然抗氧化剂，具有较强的抗氧化能力和抗炎活性，同时还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性。研究表明，迷迭香酸抑制128个基因的表达，包括多种毒力因子相关基因。迷迭香酸触发QSS反应，参与调控铜绿假单胞菌的QSS信号系统。此外，迷迭香酸诱导的7个sRNA都编码在接近QSS和 /或迷迭香酸诱导的基因区域[11]。

反式茴香油是八角油主要成分，采用QSI筛选法、lasB-gfp融合分析和毒力因子分析表明其具有QSI特性。反式茴香油在不抑制铜绿假单胞菌PAO1生长的情况下，可增加lasR的表达量、毒力因子产生量（弹性蛋白酶、蛋白水解酶、PCN）及降低群聚性分别为57%、59%、56%、95%及68%。分子对接和蛋白-配体相互作用研究表明，反式茴香油为3-O-C12-HSL类似物，可能与LasR蛋白结合而抑制铜绿假单胞菌的QSS、调控毒力因子的产生[12]。

黄芩苷为中药提取的活性天然化合物，可抑制铜绿假单胞菌的生物膜形成，剂量依赖性增强多种抗菌药物体外杀菌效果，抑制毒力因子表达。体内研究表明，黄芩苷可提高小鼠清除铜绿假单胞菌的能力，联用抗菌药物显著减少植入体中菌落的形成，明显加强清除菌体能力。病理组织学显示黄芩苷可减轻炎性反应，减少植入体周围腹膜组织的细胞浸润，提高腹腔感染小鼠的生存率[13]。

白千层属挥发油及其主要成分4-萜二醇（TTO）具有潜在的QSI作用，100 μg/mL TTO能抑制PAO1的运动能力，同时能在极低浓度时抑制铜绿假单胞菌的QSS和生物膜形成[14]。白藜芦醇可显著增强氨基糖苷类抗生素（如妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、奈替米星）对铜绿假单胞菌的生物膜形成的抑制作用，增强该类抗菌药物的疗效[15]。大麦发芽时的产物荷丁碱对奈地米星具有协同抗生物膜形成作用[16]。此外，来源于中草药具有QSI作用的还有肉桂酸、白头翁、白芷、五味子、狗脊、白菊花、木犀草、马鞭草等[17-19]。

2.2 菌类提取或人工合成的QQSSII

从人工合成的化合物中筛选具有潜在抗感染作用的化合物一直是抗菌药物研究的领域和方向。Ravithej等[20]从50种化合物中计算机筛选潜在具有抗铜绿假单胞菌活性的化合物，发现3种化合物具有QSI活性，并能抑制相关毒力因子的表达。有学者从FDA批准的1 600种化合物中筛选靶向铜绿假单胞菌与喹诺酮信号分子结合的QSI，发现clofoctol活性最强，通过作用于喹诺酮信号分子结合蛋白PasR调控PCN等毒力因子表达，并降低铜绿假单胞菌的运动能力，抑制生物膜形成[21]。该药对肺组织渗透性良好，被认为是潜在的治疗肺部铜绿假单胞菌感染的活性药物。

土曲霉中分离的terrein，能拮抗群体感应受体，减少毒力因子（弹性蛋白酶、PCN和鼠李糖脂）和生物膜形成，但不影响铜绿假单胞菌生长。此外， terrein对QSS信号分子产生及相关基因表达也有不同程度影响。terrein还可降低DGC的活性从而降低细胞内C-di-GMP水平，这一作用可被外源性QSS配体逆转[22]。黄曲霉提取物SSP13同样具有下调细胞毒力因子和群体感应生物膜形成的活性[23]。

有研究利用铜绿假单胞菌的QSI-lasI生物传感器，发现海洋镰刀菌Z10的次生代谢产物具有QSS抑制活性。经高效液相色谱法分离，获得伊快霉素。伊快霉素亚抑菌浓度可抑制铜绿假单胞菌的生物膜形成、群聚运动和毒力因子产生。对大肠埃希菌pEAL08-2、pDSY的las、PQS和rhl系统也有抑制作用，还可下调QSS相关基因mRNA的表达。伊快霉素可作为抗铜绿假单胞菌的QSI，有望通过结构优化设计开发新型抗感染药物[24]。

海藻提取的一种低分子量海藻酸盐低聚物（OligoG CF-5/20），已证实可降低铜绿假单胞菌的生物膜活性并破坏生物膜形成。生物传感器检测显示OligoG CF-5/20显著减少酰基高丝氨酸内酯（AHL）分泌，C4-HSL和3-O-C12-HSL产量也显著下降。此外，OligoG CF-5/20诱导24 h后，lasR和rhlR表达量明显减少，生物膜生成量下降呈现剂量依赖性，与抑制DNA合成有显著相关性，也与毒力因子PCN、鼠李糖脂、弹性蛋白酶和总蛋白酶的胞外产量相关[25]。

体外测试化合物的QSI活性既费时又费钱，且成功率低。计算机辅助设计与实验室筛选相结合可提高发现新活性物质的机遇。通过蛋白质文库，各种虚拟筛选法以及分子对接软件可极大提高新药的发现。FabI是烯酰还原酶催化的关键酶，在合成3-O-C12-HSL分子中起重要作用。近期有研究阐释了铜绿假单胞菌内FabI的晶体结构，在基于结构的虚拟筛选SB-VS方法中确定可能靶向烯基-酰基载体蛋白还原酶，可能有助于设计7种QSS淬灭剂[26]。

2.3 已上市具有QSI作用的药物

研究发现，已用于临床的某些药物具有潜在的QSI活性。早期研究显示，低于MIC浓度的阿奇霉素可抑制铜绿假单胞菌的QSS，降低毒力因子表达[27]，进一步研究提示其可能的作用机制为阿奇霉素影响铜绿假单胞菌群体感应相关蛋白质组学[28]。头孢他啶是治疗铜绿假单胞菌感染的第三代头孢菌素，仅使用MIC浓度的1/4 即可通过调控QSS从而显著抑制铜绿假单胞菌的生物膜形成[29]。长期、低剂量红霉素治疗非囊性纤维化支气管扩张患者的铜绿假单胞菌感染，发现群体感应基因lasR明显降低，但并没有减少细菌数量，表明大环内酯类抗生素还存在一种潜在的抑制群体感应作用的机制[30]。

HSL拮抗剂可阻断细菌之间的通信和减少毒性，从而控制感染。在亚抑菌浓度下，倍他林和倍他林酸通过抑制细胞膜多糖代谢从而显著抑制铜绿假单胞菌的生物膜和毒力因子产量。黏氯酸和黏硼酸作用于铜绿假单胞菌群体感应受体，使铜绿假单胞菌运动能力和生物膜形成下降[31]。有研究表明，乳酸对新生儿粪便中产酸乳球菌M7菌株的群体感应信号分子有影响，在一定浓度范围内，乳酸对铜绿假单胞菌短链HSL的产生和群游活性、弹性蛋白酶、蛋白水解酶、PCN以及生物被膜的产生均有抑制作用[32]。

有学者采用分子对接方法研究二甲双胍与lasR和rhlR受体的可能结合，二甲双胍能显著降低紫堇色素的生成，对PCN、溶血素、蛋白水解酶、弹性蛋白酶均有明显抑制作用，能显著降低铜绿假单胞菌的生物膜形成、浮游活性，增加对氧化应激的敏感性。研究表明二甲双胍通过氢键和静电相互作用与lasR结合，但仅通过氢键与rhlR结合 [33]。

阿司匹林是传统的解热镇痛药，具有消炎、抗风湿、抑制血小板聚集的作用。近来研究显示，阿司匹林具有抗菌增效作用，6 mg/mL可在不影响铜绿假单胞菌生长情况下显著降低群体感应信号以及弹性蛋白酶、总蛋白酶和PCN的表达。阿司匹林还可显著降低菌体活动力和生物膜生成，降低lasI、lasR、rhlI、rhlR、pqsA和pqsR基因的表达。此外，还减少假单胞菌毒素exoS和exoY的表达。阿司匹林通过交互发生的芳基、lasR受体、Tyr-88通过强π-π堆积相互作用，与阿司匹林受体复杂的构象变化有关。阿司匹林仅对铜绿假单胞菌具有抑制其毒力因子表达的作用，对大肠埃希菌无此作用[34]。

3 外排泵系统及其与QSS相互关联

过表达主动外排系统是铜绿假单胞菌耐药的主要机制之一，如MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM、MexJK-OprM、MexGHI-OpmD和MexVW-OprM，这些外排系统均属于耐药/结节化/细胞分化家族（resistance/nodulation/cell division family，RND）。研究表明，RND外排泵能对特定的群体感应信号分子进行外排，胞外的信号分子达到阈值后，与对应的群体感应相关蛋白形成复合物，提高RND外排泵基因的表达，RND外排泵基因的过量表达进一步促进QSS的调控作用[35]。RND外排泵家族与QSS之间存在紧密的相互作用，QSS参与RND外排泵基因表达的调控，RND外排泵将部分群体感应信号分子作为底物进行选择性外排，两者相互影响相互依赖[36]。

RND外排泵的特殊转运机制使其能转运不同类型化合物并以此方式参与QSS的调控，群体感应信号分子也成为RND外排泵的底物，通过QSS影响细菌的生物学特性[37]。铜绿假单胞菌的LasI/LasR、RhlR和PQS 3个QSS信号系统存在高度相关性，以C4-HSL和3-O-C12-HSL为信号分子的rhl和las，在很大程度上QSS调控铜绿假单胞菌的生物学功能。Alcalde-Rico等[38]研究发现，过表达MexCD-OprJ的nfxB突变株，胞内外3-O-C12-HSL含量均高于野生PAO1菌株；处于对数生长晚期的nfxB突变株，胞外C4-HSL含量明显低于野生株，而达平台生长早期时其含量与野生株接近，可能原因为该物质可在细胞膜内外自由弥散。过表达MexCD-OprJ同时使QSS相关毒力因子表达量减少，QSS调控相关基因表达量降低。由此可见，干扰外排泵相关信号通路能影响QSS信号传递，是一种潜在的治疗策略。

多项研究显示，外排泵抑制剂（EPI）能同时抑制QSS调控的铜绿假单胞菌的生物膜形成，含铜的EPI如纳米铜在抑制MexAM-OprM表达的同时减少生物膜形成[39]。传统EPI如Phe-Arg-ßnaphthylamide（PA ß N）可改变铜绿假单胞菌野生株PAO1和临床分离株的QSS信号分子表达和QSS调控的毒力因子表达。EPI可通过QSS降低细菌的生物膜形成能力，同时恢复传统抗生素的抗菌活性 [40]。

铜绿假单胞菌突变株群体感应受到邻近非突变株的信号调控。mexT是编码外排泵MexEF-OprN的激活因子，mexT突变株可介导MexEF-OprN活性从而调控群体感应lasR和rhlR蛋白活性。MexEFOprN介导耐药菌株抗生素MIC增加，mexT不仅能增强菌群间协作，同时在铜绿假单胞菌选择性耐药中也起协同作用[41]。RND外排泵主要依赖ATP提供动力完成膜内外药物的转运，QSS参与菌体内碳代谢的调控，负调控葡萄糖摄取、糖酵解途径、戊糖磷酸途径、能量代谢途径和核苷酸代谢途径；正调控三羧酸循环、乙醛酸循环和草酸循环 [42]。

铜绿假单胞菌耐药趋势日渐严重，极大地挑战着现有抗菌药物的疗效，新型抗铜绿假单胞菌药物的研发迫在眉睫。QSI不仅可以提高病原菌的药物敏感性，还能延缓细菌耐药，是抗感染治疗研究的新领域，但其潜在的毒性、安全性、特异性、作用机制等尚不明确，限制其临床应用。针对铜绿假单胞菌耐药靶标，寻找新的具有应用前景的抗菌增效药物，对铜绿假单胞菌感染的治疗有着深远的意义。