肠道菌群在针灸治疗缺血性脑卒中的作用研究*

马继红，彭拥军△，孙建华，芦 芸，朱冰梅

(1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029;2.四川大学华西医院,四川 成都 610041)

在中国，缺血性脑卒中(Ischemic stroke,IS)的治疗除了严格按照指南规定外，中医传统的针灸疗法也充分发挥了其优势作用，并且在临床治疗上也取得了良好的治疗效果[1]。然而，针灸对于IS治疗的作用机制是复杂的，目前尚不完全被人们所认知。在最新的一系列研究发现,肠道菌群与IS的发生发展及转归预后有着紧密的联系，肠道菌群及其产物直接参与了血小板活性的激活及血栓的形成[2]，可通过调节肠道菌群，降低免疫炎症反应，促进缺血损伤组织及神经功能修复[3]。基于当前研究，本研究深入剖析了肠道菌群及其介导的免疫炎症反应与IS的相关性，并探讨针灸通过调控肠道菌群-免疫炎症反应促进损伤恢复的可行性。

1 肠道菌群失调与IS的相关性

正常人体肠道内栖息着庞大的微生物群体，其数量和种类繁多且结构复杂，是体细胞总数的10倍之多，被称为“人类第二基因组”。根据肠道菌群对宿主的作用可分3类:生理性有益菌群、致病菌群、机会菌群，其中有益菌群作为优势菌占绝大多数(99%～99.9%)，存在宿主特异性。根据菌群门类则可分4个门类：厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门等[4-6]。生理条件下，定植于宿主肠道内的菌群处在相对平衡和稳定的状态，对机体的健康有着十分重要的意义。

肠道菌群与IS的研究是近年来卒中领域新兴热点研究，根据当前研究显示，肠道菌群在IS的发生及预后中发挥重要作用，且对卒中患者的具体作用是复杂多样的，包括直接参于血小板激活、动脉粥样硬化斑块的形成；以及间接对卒中相关危险因素(如高血脂、高血压、糖尿病等)的影响[7-10]。Swidsinski等[11]通过对卒中患者的肠道菌群进行动态观察，发现卒中患者肠道中的常驻菌和致病菌在发生脑卒中后均出现变化。范文涛等[12]通过使用Roche/45高通量测序对卒中后抑郁症患者大便标本中16S RNAV3区进行定性分析发现，卒中后抑郁症患者肠道微生态环境中细菌群落的多样性和均衡性与正常人群存在明显差异，特征性表现为潜在致病菌肠杆菌科构成比例显著增加而抗炎性细菌减少，该研究证实患者肠道菌群状态与卒中后抑郁状态之间具有内在关联[13]。游超等[14]对脑梗死患者和健康人的粪便中细菌DNA进行分析后也发现，脑梗死患者肠道菌群发生显著改变(P<0.01)，肠道中机会致病菌肠杆菌科、韦荣球菌科和链球菌科等显著增加，而常驻菌如普氏菌属和拟杆菌属等显著减少。同时发现，4周后脑梗死患者肠道菌群结构开始趋向于对照组，但伴随菌群多样性的显著下降(P<0.05)。有关研究进一步发现，脑缺血再灌注小鼠粪便菌群多样性减少、普雷沃氏菌相对丰度下降,菌群组成结构发生明显变化,且与缺血区神经元损伤、细胞凋亡相关[15]。而最新的研究中，给予重症脑卒中患者肠内营养液中添加双歧杆菌辅助治疗后，患者粪便中乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌等数量显著多于对照组，大肠杆菌、肠球菌和小梭菌显著少于对照组，说明双歧杆菌可以有效的调节肠道菌群紊乱，增强卒中患者肠道免疫力，从而降低并发症的发生，继而促进卒中患者的恢复[16]。

2 免疫炎症反应与IS的相关性

IS的病因病机十分复杂，而其中免疫炎症反应被激活在整个发病机制中起着重要作用。与兴奋性毒性作用和氧化、亚硝化作用相比，缺血性脑卒中后免疫炎症反应持续时间更长，从快速损伤期到恢复期，免疫反应均参与其中。免疫调节系统可以通过多种方式控制机体对自体抗原的主动应答,防止其对损伤组织的过度免疫反应。其中,调节T细胞(regulatory T cells，Treg细胞)对主动免疫力的抑制是维持免疫稳态和减轻炎症损伤的关键之一[17]。Treg细胞表达CD25+CD4+表面抗原，因而被称为CD25+CD4+Treg细胞。在不同的内环境条件下CD4+T细胞可以分化为不同类型的细胞，有辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞)1、Th2、Th17以及诱导性Treg细胞[18]。固有免疫系统中CD25+CD4+Treg的减少诱导自身免疫性疾病,但重建这种细胞群体可防止疾病发展[19]。最新大量研究显示，CD25+CD4+Treg和Th17细胞介导的外周免疫反应在缺血性脑卒中发病机制扮演重要作用。

2.1 缺血性卒中后的免疫激活

脑卒中后的免疫反应是一个动态演变的过程，其中，主要参与的免疫炎症细胞有脑常驻小胶质细胞和血液源性白细胞[20]。研究报道，固有小胶质细胞激活是脑梗后炎症反应的第一步[21]，IS发生数分钟后，局部脑组织及神经元细胞因缺血坏死释放大量的损伤相关蛋白，如高活动性组蛋白、趋化因子、白介素33热休克蛋白、三磷酸腺苷等，免疫炎症级联反应被激活，局部损伤脑组织中促炎因子上调，这些损伤相关的蛋白分子与其下游受体-Toll样受体结合引起中枢固有免疫细胞如常驻小胶质细胞的活化，导致血脑屏障破坏，外周免疫细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)向中枢侵润聚集，聚集至中枢的免疫细胞通过多种方式影响神经元，包括直接杀伤神经元或间接释放炎性因子,促进兴奋性毒性作用，或活化巨噬细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞等，进一步加重脑损伤[22-23]。

2.2 缺血性卒中的免疫调节干预

在缺血脑组织中有大量的T淋巴细胞募集,其中以CD4+辅助性T细胞数量为主。IS发生后外周血中的Treg细胞进入颅内，导致外周血中Treg细胞减少,而脑组织中Foxp3(Treg分化调节剂)表达增加。杨双文等[24]研究发现，大脑中动脉缺血小鼠在缺血/再灌注早期脑水肿逐渐加重，梗死病灶的体积不断扩大，在12 h,Treg细胞比例开始下降，而1天时Treg细胞降至最低，之后开始逐渐恢复，而在第5天时又明显增加。这一趋势变化与脑组织病理改变过程相一致。陈瑞清等[25]研究发现，脑缺血后1天，脑组织中Foxp3启动表达，在脑缺血组的全脑中均可见Foxp3表达为阳性，而正常对照组脑组织中则Foxp3表达为阴性，说明急性脑缺血可引起全身性的适应性免疫反应且在脑缺血后1天时Treg细胞开始参与到IS的免疫调节中。此外，研究表明在急性脑梗死患者的外周血中Th17细胞、IL-17A水平均增高,而IL-17A是由Th17细胞分泌的，是多种炎症相关疾病的关键细胞因子之一，其水平的升高多与患者神经功能缺损有相关性[26]。Dolati S等[27]发现,脑缺血患者外周血Treg细胞比例及Foxp3表达水平降低,而Th17细胞比例上升,而这种变化与IL-17A的表达相关，提示IS发生后外周血中Th17细胞比例的增加和Treg细胞比例的减少是加重脑损伤的关键因素。

3 针灸通过调控“肠道菌群-免疫反应”治疗IS可行性

3.1 肠道菌群介导的免疫炎症反应与IS的发生及预后密切相关

胃肠道淋巴组织是机体免疫细胞最大的栖息地，肠道菌群寄生于肠道内，是机体最丰富的共生者。正常情况下，机体内肠道优势菌群和免疫系统保持动态平衡，但是当机体发生胃肠功能障碍时，肠道内寄生的细菌大量增殖，破坏了肠道的免疫屏障，引发机体肠道免疫反应，严重影响病人的预后[28-29]。Telesford等[30]回顾了有关肠道菌群及其对免疫系统调节作用的相关文献，发现肠道菌群能够影响全身免疫细胞及细胞因子的分泌,主要机制是通过促炎性Th1和Th17产生免疫应答反应，以对抗抗炎性Th2型免疫反应。相关研究表明，在IS的脑损伤时，肠道菌群失调能够直接影响免疫细胞，主要是影响Treg细胞和IL-17+γδT细胞，而两者均参与IS的脑损伤过程[31]。其中，γδT细胞大部分存在于肠道上皮表面[32]，具有固有免疫作用。肠道菌群紊乱，γδT细胞分泌大量IL-17并引起周围的中性粒细胞和单核细胞产生趋化作用，进而加重对IS的损伤[33-34]。Benakis等[35]研究发现，在克拉维酸敏感以及不敏感的大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)小鼠模型中，通过对敏感的MCAO小鼠进行长达3周的治疗后，将其粪便移植到克拉维酸不敏感的MCAO小鼠中，结果发现，经过粪便移植的克拉维酸不敏感MCAO小鼠脑梗死面积较未经粪便移植的小鼠减少了54%。导致这一结果主要是由于IL-17+γδT细胞的减少和Treg细胞增加，限制了IL-17+γδT的细胞炎性物质进入脑膜。由此可见，在IS的发生、发展过程中，肠道菌群和IL-17+γδT细胞发挥重要作用。同时，该实验发现，在急性脑损伤后期的缺血组织中发现Treg细胞，其分泌大量抗炎细胞因子(IL-10)，IL-10通过抑制IL-17+γδT细胞，进而发挥神经保护的效应[36]。然而，有关研究发现，在卒中急性期时未发现过继转移的Treg细胞进入脑实质，说明Treg细胞是通过调节外周免疫系统继而发挥保护作用[37]。

3.2 针灸对肠道菌群失调及免疫炎症反应有良好的调节作用

3.2.1 调控肠道菌群 一直以来便秘、腹泻、溃疡性结肠炎、肠应激综合征等胃肠道疾病都是针灸临床的优势、有效病种，以此为基础的研究也充分证实了针灸对胃肠运动和分泌具有良好的调节效应[38-40]。并且相关实验显示，针灸可提高胃肠的免疫，即通过针刺和艾灸等手法能增加血清中免疫球蛋白浓度，增强肠道局部免疫，产生保护肠道黏膜的作用[41]。

近年来，更多的研究者开始关注针灸对胃肠道中菌群的调节作用，大量的研究也发现，针灸可以有效的调控肠道菌群。针灸疗法可以通过不同的选穴配伍、操作方法等改善肠道菌群的多样性和有益菌的数量，实现调节机体功能、发挥治疗的作用。例如，针刺便秘型肠易激综合征(IBS)患者相应腧穴，可使肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌数量增加，大肠埃希菌数量减少[42-43]。而在对溃疡性结肠炎(UC)大鼠肠道菌群的研究中发现，UC大鼠肠道菌群丰度及多样性较对照组显著降低，且致病菌含量明显增高，实验通过电针UC大鼠的天枢、足三里、上巨虚穴，大鼠肠道菌群的丰度值及多样性明显提高，提示其可能因针灸相关腧穴可起到调整肠道菌群有关[44]。在最新的研究中，张博等[45]通过对100例慢性UC患者进行随机分组研究发现，针灸联合中药治疗后观察组的肠道菌群改善情况优于对照组(均P<0.05)，且Th17细胞比例、Th17/Treg比值显著降低，Treg细胞比例显著升高，观察组上述细胞比例改善情况优于对照组(均P<0.05)，提示其可能与改善肠道菌群失调、促进Th17/Treg细胞免疫平衡从而抑制炎性反应有关。相关研究发现，隔药灸天枢与气海穴可以提高UC大鼠肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌含量，同时降低大肠杆菌和枯草杆菌的含量，其主要机制可能为隔药灸调节大鼠肠道菌群、抑制TNF-α和IL-12的表达、调节肠道的免疫应答作用[46]。

3.2.2 调控免疫炎症反应 IS发生后的炎症级联反应是脑缺血损伤的重要原因之一，而针灸对缺血发生后的免疫炎症反应的调控作用无论在实验研究还是临床研究都已被证实。在免疫炎症的过程中，调节Treg细胞对主动免疫力的抑制是维持免疫稳态和减轻炎症损伤的关键。临床研究发现[47]，针刺可明显改善卒中患者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平，改善机体细胞免疫功能，提高脑卒中患者运动功能及日常生活活动能力，缩短病程。并且根据前人的研究分析发现，针灸可以抑制缺血再灌注大鼠脑内小胶质细胞的活化，调控缺血脑组织中细胞炎性因子释放。例如，研究发现[48]，电针缺血再灌注模型大鼠的曲池、足三里，可以通过调节TLR4(Toll样受体40)/NF-КB信号通路、降低炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，从而改善神经功能缺损、减少梗塞面积。倪光夏等[49]运用RT-PCR方法,观测急性局灶性脑缺血再灌注大鼠不同时间点病变侧大脑皮层的白细胞介素-1(IL-1RI)和肿瘤坏死因子受体I(TNFR-I)表达情况，以及针刺对上述观测指标的调节作用规律发现，针刺降低了大鼠脑缺血再灌注后大脑皮层异常升高的IL-1RI和TNFR-I，进而对脑损伤起保护作用。陈素辉等[50]发现，在IS急性期，针刺百会和足三里穴可通过调节TNF-α的过度表达，减轻脑缺血损伤大鼠脑组织的炎症反应。刘丹等[51]在观察双侧颈总动脉永久结扎的慢性脑缺血大鼠模型实验中发现，督脉电针可以通过调节大鼠缺血脑组织中IL-1β和TNF-α的表达，抑制炎性反应，促进缺血损伤神经功能的恢复，该实验还发现，与缺血形成后治疗相比，早期督脉电针治疗效果更好。

4 小结

脑缺血发生的应激环境下，肠道菌群及其介导的免疫系统稳态失衡，可能加重缺血脑组织的损伤，而通过纠正肠道菌群微生态失调，降低免疫炎症反应，可能促进IS损伤后的脑组织及神经功能恢复。目前，关于针灸调控肠道菌群的研究多集中在肥胖、肠易激综合症、溃疡性结肠炎等方面，而关于针灸调控肠道菌群在IS方面的研究确不多。虽然肠道菌群介导的免疫炎症反应对IS后损伤的恢复的作用已经引起越来越多研究者的重视，而且大量临床和动物实验都证明了针灸疗法在调节肠道菌群和免疫炎症反应中的作用。但针灸通过调节“肠道菌群-免疫反应”对IS的治疗在卒中领域的有关研究结果尚不明确,因此，今后应多方面深入探究肠道菌群介导的免疫炎症反应在治疗IS患者方面的应用，为针灸治疗缺血性脑卒中提供新思路、新靶点。