前列腺增生组织细胞凋亡及bcl-2癌基因表达的作用与前瞻性研究

王海生 荣 阳 荣根满

（1 辽宁省辽阳市中心医院泌尿外科，辽宁 辽阳 111000；2 辽宁省辽阳市中心医院医务处，辽宁 辽阳 111000；3 中铁十九局集团中心医院医务科，辽宁 辽阳 111000）

良性前列腺增生（benign prostate hyperplasia，BPH）是一种慢性、老年性、增生性疾病。就前列腺增生及其因素研究已有许多报道，但在增生组织中细胞凋亡和相关癌基因表达调控研究甚少。我们应用脱氧核苷酸末端转移生物素标记脱氧尿嘧啶（terminal deoxynucleotidyl transferose -me-diated dutp-biotin nickend labeling，TUNEL）和mRNA原位分子杂交技术，检测30例BPH组织病理中，细胞凋亡和bcl-2癌基因表达变化。从而分析细胞增殖、凋亡与癌基因的关系，了解不同组织病理类型的BPH的发展趋势。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 对象：2016年1月至2017年12月行前列腺摘除术的BPH，选择以弥漫性增生，无结节形成的30例BPH患者的前列腺增生组织标本。

1.1.2 主要试剂：寡核苷酸3′末端标记生物素探针试剂盒，地高辛标记检测试剂盒。生物素碱性磷酸酶染色试剂盒，bcl-2质粒，限制性内切酶，琼脂糖等（均购自sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 标本制备：将摘除的前列腺置于40%多聚甲醛缓冲液中16 h以上，脱水浸蜡，包埋，连续切片6～10 μm，贴附在黏附剂包被的载玻片上。

1.2.2 探针标记：将bcl-2质粒定量与限制性内切酶混合，37 ℃反应3 h，进行DNA琼脂糖电泳，在长波紫外线下切除bcl-2DNA条带，低温离心，酚-氯仿提取，冷乙醇-20 ℃沉淀20 h，高速离心，弃上清，将沉淀溶解；置于100 ℃ 10 min，迅速置于冰浴3 min，加入六核苷酸引物，地高辛标记dNTP，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Kenow片段，37 ℃ 1 h，终止反应，在冷乙醇-20 ℃沉淀2 h，高速离心，弃上清干燥，再溶解备用[1]。

1.2.3 TUNEL技术：将6 μm的组织切片置于70 ℃烤10 min，脱蜡入水，在20 μg/mL蛋白酶K溶液中消化15 min，冲洗后覆盖含有末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）0.3 U/μL、生物素化dUTP（bio-11-dUTP）1 mmol/L的TDT缓冲液（30 mmol/L Tris-HCl PH7.2、140 mmol/L溴肿酸钠、1 mmol/L氯化钴）37 ℃ 1～2 h，终止反应，进入碱性磷酸酶显色，3%牛血清白蛋白（BSA）封片，加链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物（SA-AP）1∶200，37 ℃1 h，冲洗，在四氮唑蓝（NBT）和5-溴-4-氯-3吲哚磷酸盐（BCIP）液中，室温暗处显色[2]。

1.2.4 mRNA原位分子杂交：将10 μm组织均片置于30 ℃干燥，脱蜡入水；浸入0.2 NHCl液20 min，入2×ssc（1000 mL液中含NaCl 175.3 g，柠檬酸钠88.2g）50 ℃ 30 min，在3 μg/mL溶液中37 ℃消化15 min，分别浸入0.2%甘氨酸，0.25%乙酰酐和0.1 mol/L三乙醇胺，室温各10 min，过梯度乙醇，空气干燥；42 ℃预杂交2 h；42 ℃杂交16～19 h，2×ssc 40 ℃冲洗30 min×4，1×ssc 40 ℃15 min×2，0.1×ssc 40 ℃15 min×2；分别浸入缓冲液Ⅰ（150 mmol/L NaCl、0.1 mol/LTris-HCl pH 7.5）和30%BAS，室温5～30 min，加盖含有地高辛-AP（1∶500）缓冲液Ⅰ，37 ℃1.5 h，分别用缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ（0.1 mol/LTris-HCl pH 9.5，0.1 mol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2、）浸洗，在NBT和BCIP缓冲液Ⅱ中显色1～3 h，自来水冲洗，甲绿复染，封片[3]。

2 结 果

在光学显微镜下BPH的组织病理显示，前列腺腺上皮细胞单层排列，间质增生。TUNEL方法检测到的凋亡细胞分布在前列腺腺上皮细胞，大量的腺上皮细胞的细胞核染色质沿核膜凝集形成环状或半月状，核收缩呈深蓝色着色，核质内空泡形成，间质无着色。mRNA原位分子杂交检测bcl-2癌基因表达，在前列腺上皮细胞表达阴性，而增生的间质中bcl-2癌基因阳性表达，分布密集，呈深5蓝色着色。

3 讨 论

细胞动学过程包括细胞增殖，分化和死亡，三者之间的平衡才能维持某器官形态，大小和功能、维持这一过程的细胞死亡不同于细胞坏死，它是一个自然的生命结束，因此有它病理形态上的特征，共分三期，一期细胞核染色体DNA沿核膜凝集成新月状或环状。核和胞质收缩，二期以发芽形式将核和胞质混合分离成多种形态有包膜的凋亡小体；三期该小体被邻近的吞噬细胞吞噬消化，不留任何痕迹。这种自然消失的细胞就象树叶凋谢一样，称为细胞凋亡（Apoptosis），它的发展过程是受遗传素质，各种细胞损伤性刺激改变了遗传信息的转录和／或翻译（如癌基因异常表达）形成死亡蛋白，后者能激活核酸内切酶，引起核染色体DNA凝集和断裂，这标志着细胞凋亡开始。本研究观察前列腺腺上皮细胞的细胞核变化符合细胞凋亡形态特征，表明BPH的组织增生类型不同，即以腺上皮细胞增生为主的BPH；和以间质增生为主，腺上皮细胞凋亡的BPH；从而推测BPH的组织增生类型的不同可能与病因不同有关，进一步了解不同的诱发因素，将给临床非手术治疗提供理论依据[4]。

在前列腺组织中，激素，细胞因子和各种癌基因形成一个调节网络。当这个网络发生改变后，就可能造成前列腺不同细胞增殖和／或凋亡异常，引起不同细胞总数增加，导致前列腺体积增大。BPH组织病理两种类型中，腺体及导管上皮增生可能与雄激素降低无关，与其他因素有关，而间质增生可能与雌激素水平在间质中明显高于腺上皮细胞以及其他因素有关。给予人类BPH芳香化酶抑制剂后，可使前列腺缩小，排尿梗阻症状改善。对狗去势后，再置入睾丸剂，使缩小的前列腺恢复原状，说明前列腺增生组织中有雄激素依赖的敏感细胞发生凋亡，这一点与本研究结果相符[5]。

目前最关注的研究是前列腺增生组织中癌基因与细胞增殖和凋亡的关系。其中最为关系密切的癌基因是bcl-2，它是从滤泡性淋巴瘤分离出来的一种癌基因，是在t（14、18）染色体易位断点处发现的一种癌基因，其蛋白位于线粒体内膜。研究发现bcl-2癌基因抑制细胞凋亡，延长细胞寿命。在人类目－2蛋白表达仅局限在正常前列腺组织中基底细胞内。以腺体及导管增生为主的BPH，腺上皮细胞中bcl-2蛋白阳性表达率明显增高。提示在雄性激素降低的情况下，维持前列腺增生组织腺上皮细胞寿命和增生并逃避细胞凋亡的原因很可能与bcl-2蛋白高表达有关。本研究发现前列腺增生组织腺上皮细胞bcl-2癌基因阴性表达，使大量的腺上皮细胞凋亡；而间质中的bcl-2癌基因强阳性表达，更进一步促进间质的增殖。从上述研究资料推测与前列腺癌前病变密切相关前列腺上皮内肿瘤（PIN）和非常典型性腺瘤样增生的BPH[6]，很可能与腺上皮细胞内bcl-2蛋白表达有关。

BPH的不同组织病理类型，其细胞增殖和细胞凋亡表现不同。前列腺增生组织腺上皮细胞凋亡是存在的。腺上皮细胞的增殖和凋亡，以及间质的增殖，除与激素有一定关系外，更重要的是受bcl-2癌基因的调控。对bcl-2蛋白高表达的腺上皮细胞是否是前列腺癌前癌变的高发类型的BPH，还有待进一步研究。了解BPH不同组织类型和不同的引发因素，将为今后非手术治疗BPH提供理论依据。