低氧下K562细胞红系分化模型的构建#

胡彩艳，刘 芳，付成冰，丁 谨，张慧洁

(青海大学医学院生化教研室，青海 西宁 810001)

目前，高原红细胞增多症(high altitude polycythemia，HAPC)的发病机制尚无定论。在研究过程中证实多种蛋白因子和miRNA参与其中，如GATA-1、HIF、miR-451a等[1]。目前研究发现，通过细胞造模的方式模拟正常红系发育过程已成为广泛采用的实验手段。K562、MEL、TF-1细胞等已成为国际通用的造模细胞，这其中人类白血病K562细胞被广泛用作适合于红细胞生成研究的模型细胞系[2]。文献显示，K562细胞行为上更像是未分化的早期多潜能造血祖细胞[3]。其可被多种不同的诱导剂诱导向不同细胞系分化[3-4]，其中K562细胞可以被分化诱导剂(如氯高铁血红素等)诱导向红系分化，出现红系分化成熟的标志物，如胎儿血红蛋白、唾液酸糖蛋白、乙酰胆碱酯酶等。在低氧下利用K562细胞建立红系分化模型时采用的氧浓度条件存在差异，有的实验人员采用1%氧浓度为条件[5]，也有采用3%氧的情况[6]。

基于此，我们在不同氧浓度下分别建立红系分化模型，并选择出更为合适的氧浓度作为建模条件，以该模型为基础探讨低氧环境对红系分化过程中相关miRNA功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂、仪器

K562细胞购于中乔新舟公司，RPMI-1640培养基购自HyClone公司，胎牛血清(FBS)购自四季青公司，总RNA提取试剂盒购自北京天根公司，mRNA逆转录试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司，qRT-PCR试剂盒购自美国QIAGEN公司，CD235a流式抗体购自Biolegend公司，MTS溶液购自Promega公司，PI染液购自BD公司。

Binder三气培养箱、Eppendorf PCR扩增仪、ABI7500荧光定量PCR仪、Beckman流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 分组

按细胞培养条件分为3组，常氧组(37℃，5%CO2，21%O2，饱和湿度)、1%低氧组(37℃，5%CO2，饱和湿度、N2)及3%低氧组(37℃，5%CO2，饱和湿度、N2)。以上三组细胞分别加入hemin诱导0、48、72、96 h。

1.2.2 实验

(1)细胞阳性率检测

用联苯胺染色检测细胞阳性率：收集造模完成的三组细胞，加入联苯胺溶液15 μL、3%H2O210 μL，3 min后加入1 μL硝普钠溶液；10 min后观察染色结果。

(2)γ-globin表达水平检测

用qRT-PCR法检测γ-globin表达水平：分离提取total RNA，逆转录成cDNA后检测细胞中γ-globin的表达水平。引物序列见表1。

(3)表面标记CD235a 的表达变化检测

表1引物序列

Table 1Primer sequences

用流式细胞术检测表面标记CD235a 的表达变化：收集细胞样品用PBS洗两遍后，用PBS重悬至细胞浓度为1×106个/mL，从中取出100 μL细胞悬液转移到流式管中，加入CD235a抗体5 μL，混匀后避光孵育15 min；加入1 mL PBS清洗去多余抗体，离心后加入500 μL PBS重悬，过筛后上机检测。

(4)细胞增殖水平检测

用MTS细胞增殖实验检测细胞增殖水平：存放上述三组细胞的孔中加入20 μL MTS溶液，混匀后置于37 ℃孵育1～2 h，在490 nm波长处测量各孔的吸光度值。

(5)细胞周期检测

用流式细胞仪检测细胞周期情况：采用血清饥饿法将K562细胞做同步化处理，取同步化后的细胞按实验设计处理。在收集的细胞沉淀中逐滴加入70%～80%的乙醇固定，过夜(4℃)后；清洗两遍，加入500 μL PI染液混匀，室温避光孵育15 min，过筛后上机检测。

(6)细胞凋亡检测

用流式细胞仪检测细胞凋亡水平：收集样品用PBS清洗两遍后，用PBS重悬，分别加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，混匀后孵育(室温，避光)15 min，上机检测。

1.2.3 统计学处理

2 结果分析

2.1 对比不同时间点的细胞增长速率确定指数增长期

查阅文献得知，在建立细胞模型时，通常选用指数增长期的细胞进行给药处理能够获得更好的实验结果。因此，我们每隔24 h对传代的细胞进行计数并绘制生长曲线确定指数增长期。如图1所示，48～72 h细胞增殖速度最快，为指数增长期，所以我们选择在此时间段内对细胞进行诱导处理。

图1细胞生长曲线

Figure1Growthcurveofthecells

2.2 对比不同hemin浓度下的分化程度

为确定合适的hemin浓度，我们分别采用30、40 μM的剂量进行细胞诱导，诱导时间为48、72、96 h。结果如图2、表2所示，依据结果，我们选择40 μM的剂量进行细胞诱导。

图2联苯胺染色结果(100×)

Figure2Resultsofbenzidinestaining(100 ×)

Table 2The positive cell rate of Benzidine staining induced by different concentrations of

*：组间比较，P<0.05

2.3 对比不同氧浓度下的分化效率

(1)联苯胺染色检测阳性细胞率

如图3、4和表3、4所示，不同氧浓度下联苯胺染色阳性细胞率表明，组内不同时间点间，阳性细胞率均呈上升趋势(P<0.05)；对比常氧与低氧组可以看出，低氧组的阳性细胞率高于常氧组(P<0.05)，并且1%氧浓度下，常氧、低氧间阳性率的差异更为明显。

图3 1%O2联苯胺染色结果(100×)

Figure3Theresultsof1%O2Benzidinestaining(100 ×)

组别n24h(%)48h(%)72h(%)96h(%)FP常氧组320.92±2.3134.15±5.87#58.23±0.88#66.97±2.49#115.9150.0001%低氧组318.56±2.3749.32±7.23∗#64.86±0.47∗#74.41±1.53∗#118.6290.000t 2.607 -2.789 -11.511 -4.045P 0.060 0.049 0.000 0.016

#：组内24h比较，P<0.05；*：同一时间点常氧组比较，P<0.05

图4 3%O2联苯胺染色结果(100×)

组别n24h(%)48h(%)72h(%)96h(%)FP常氧组319.78±0.5437.43±0.53#50.91±1.85#57.85±0.45#804.4730.0003%低氧组321.27±0.7840.89±4.05#54.85±0.95#59.76±1.96#164.0590.000t -2.720 -1.330 -3.281 -1.645P 0.053 0.254 0.03 0.175

#：组内24h比较，P<0.05；*：同一时间点常氧组比较，P<0.05

(2)qRT-PCR检测γ-globin变化

结果如表5、6所示，随着时间点的延长，γ-globin的表达水平呈现上升趋势，其中在96 h低氧组表达水平明显高于常氧组，差异有统计学意义(P<0.05)；在不同氧浓度条件下，我们发现尤其在96 h时，1%氧条件下γ-globin表达水平是常氧组的2.5倍，而3%氧条件下γ-globin的表达水平是常氧组的1.4倍。

Table 5The detection of γ-globin by qRT-PCR at 1% oxygen

#：组内0h比较，P<0.05；*：同一时间点常氧组比较，P<0.05

Table 6The detection of γ-globin by qRT-PCR at 3% oxygen

#：组内0h比较，P<0.05；*：同一时间点常氧组比较，P<0.05

(3)流式检测CD235a的表达变化情况

结果如图5、表7所示，经流式细胞仪检测，从不同氧浓度条件下CD235a阳性细胞的比例变化看出，在1%氧的条件下低氧96 h显著高于常氧(P<0.05)，且阳性细胞率高于3%低氧条件；在3%氧条件下CD235a的比例随着时间的延长，呈逐步下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。

图5不同氧浓度下CD235a阳性细胞率流式结果图

Figure5FlowcytometryresultsofCD235apositiveratioofcellsatdifferentoxygenconcentrations

Table 7Changes of CD235a positive cell rate at different oxygen

#：组内0h比较，P<0.05；*：同一时间点常氧组比较，P<0.05

2.4 对比不同氧浓度对细胞增殖的影响

(1)MTS细胞增殖实验检测细胞增殖水平变化

MTS细胞增殖实验结果如表8所示，常氧和低氧状态下细胞增殖率的差异无统计学意义(P>0.05)，同时1%氧浓度和3%氧浓度下细胞增殖率差异也无统计学意义(P>0.05)。

Table 8MTS proliferation at different oxygen

(2)流式检测细胞周期变化情况

流式细胞仪检测细胞周期结果如图6、表9所示，K562细胞无血清培养24 h后，约有53%的细胞阻断在G0/G1期，常规培养并经hemin诱导后，做不同氧浓度与常氧对比发现，S期与G2/M期的细胞所占比例差异无统计学意义(P>0.05)，表示无论1%还是3%O2条件下，处于增殖期的细胞比例无明显差异。

图6不同氧浓度下细胞周期流式结果图

Figure6Flowcytometryresultsofcellcycleatdifferentoxygenconcentrations

Table 9Cell cycle results at different oxygen

2.5 对比不同氧浓度对细胞凋亡率的影响

用AnnexinV-PI细胞凋亡检测试剂盒检测。为检测不同氧浓度下，由hemin诱导后的细胞的凋亡水平经流式细胞仪分析后发现，随着时间点的延长，细胞凋亡率出现上升趋势；但不同氧浓度条件下的细胞凋亡率均与常氧情况无明显差异，结果如图7、表10所示。

图7不同氧浓度下细胞凋亡流式结果图

Figure7Flowcytometryresultsofcellapoptosisatdifferentoxygenconcentrations

Table 10Cell apoptosis rate at different oxygen

3 讨论

近年来国内外学者对HAPC发病机制从分化、增殖和凋亡三方面进行深入探讨。有研究发现，低氧条件下促红细胞生成素(EPO)等红系分化相关因子表达被促进，通过与骨髓中的相应受体结合来促进造血干祖细胞向红系分化[7-8]。也有学者证实，慢性缺氧可通过上调各种核转录因子如血管内皮因子(VEGF)等介导红细胞的增殖[9-10]。

红细胞生成是红细胞生成过程的一个多步骤过程，由内在自身因素和外在环境因素共同控制[11]。机体中的氧含量是影响红细胞生成的重要因素之一[12]。骨髓微环境中的氧水平控制着红细胞祖细胞和基质细胞之间的相互作用；并且，氧含量的变化也能够影响珠蛋白基因的表达[13-14]。

人类红细胞样细胞系、K562细胞系，来自于白血病患者的细胞在常规培养过程中成长为单一的、未分化的细胞，并且其自身血红蛋白表达水平低。因此，其被一些学者作为模型应用于分子水平检测红系分化水平。当受到某些药物刺激时，如氯化血红素，其能够在几天内作出反应(在血红蛋白的产生和其他一些红细胞特殊标记物的表达上有明显的增加)[15]。

在应用K562细胞系建立低氧下红系分化模型时发现，不同的实验小组对于hemin浓度和氧浓度的选择存在差异。根据细胞的不同时间生长特性，我们选择在其细胞活性最佳时期对其进行诱导。作为诱导剂的hemin本身对细胞存在毒性，并且浓度越高毒性越大，影响细胞正常活动。因此，为确保后期实验顺利进行，对于诱导剂浓度的选择尤其重要。以往文献报道，常用hemin浓度为30或40 μM[16-19]，我们分别采用两种浓度诱导细胞分化，以联苯胺染色法检测诱导效率，最终确定hemin浓度为40 μM。氧浓度则是我们建立低氧下红系分化模型至关重要的条件，合适的氧浓度不仅能够使相关基因的表达水平与常氧条件下呈现明显差异，同时最大程度避免对细胞正常生命活动的影响，也为后期检测不同蛋白因子及小RNA的变化奠定基础。为探究更为合适的氧浓度，我们在不同氧浓度下建立了细胞模型，采用联苯胺染色法检测细胞阳性率、实时荧光定量PCR法检测γ-globin、流式法检测红系特异表面标记CD235a来确定模型建立是否成功，并确定分化效果更为理想的建模条件。

本研究结果显示，在分化水平上，从联苯胺染色结果来看，1%氧条件下，72、96 h常氧低氧差异更为明显；从CD235a的流式检测结果来看，CD235a通常在红系分化过程的中晚期开始表达，晚期呈高表达，由于K562细胞自身CD235a的表达水平较高，所以在K562红系分化模型中先出现下降趋势，随着诱导分化进程延伸，出现上升趋势。3%氧条件下，在0～96 h间持续下降，低氧表达水平高于常氧；而在1%氧条件下，则出现先下降后上升的变化趋势，由此可见1%氧条件下加速了红系分化的进程；从γ-globin 的qRT-PCR检测结果来看，1%氧条件下，96 h低氧组的表达水平是常氧的2.5倍；但3%氧条件下，这一倍数仅为1.4，因此，1%氧在促进红系分化的过程中作用更加显著。无论氧浓度为1%或3%，细胞的增殖率并无明显差异，说明不同浓度氧对细胞增殖的影响无明显差异；凋亡率结果显示，低氧能够增加细胞凋亡率，且1%O2凋亡率略高于3%O2，但差异无统计学意义。由此我们认为，选择1%氧浓度作为建立低氧下红系分化模型的条件更为合适。

综上所述，本实验确立的实验参数，构建了符合试验要求的较为理想的K562红系分化模型(低氧下)，为后期miRNA的检测奠定了基础。