金银花及其制剂中掺伪山银花的快速鉴别研究

王立伟，徐 达，安丽娜，申玉龙，金艳敏，宋长国

（承德燕峰药业有限责任公司，河北 承德 067600）

山银花和金银花系忍冬科植物，收载于2015年版《中国药典（一部）》［1］，其中规定金银花来源于忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，山银花来源于灰毡毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.，红腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.，华南忍冬Loniceraconfuse DC.或黄褐毛忍冬 Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花。但两者在2000年版《中国药典》前为同一品种［2］，之后药典又将山银花从金银花中分列出来，作为单列品种［3］。两者性状特征较相似，但金银花价格要高出山银花很多，故在金银花及其投料制剂中掺伪山银花的情况屡见不鲜［4］。曾有报道，以山银花的特征成分灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙可鉴别山银花和金银花［5-7］。又有报道，绿原酸、木犀草苷和灰毡毛忍冬皂苷乙是金银花和山银花的共有成分，只有川续断皂苷乙才是山银花的专属成分［8］。但因其含量远较灰毡毛忍冬皂苷乙低，特别是掺伪的情况下，再折算提取率，导致取样量太大，方法无应用价值。还有人对金银花和山银花从不同方面进行了对比分析［9-12］。为能简便快捷地识别在金银花及其制剂中掺伪的山银花，本研究中用高效液相-蒸发光散射检测器（HPLCELSD）对灰毡毛忍冬皂苷乙的特征斑点进行定量确认，可快速、准确鉴别金银花及其制剂中掺伪山银花，掺伪量在2%以上即可准确判断。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司，包括LC-20AT型四元泵，SIL-20型自动进样器，CTO-10AS vp型柱温箱，LCsolution型色谱工作站）；ZAM 4000X型蒸发光散射检测器（德国珊贝克公司）；数控超声波清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试药

清开灵颗粒（K厂家，批号为170509），清开灵片（L 厂家，批号为 1703004；M 厂家，批号为 170308），双黄连颗粒（N厂家，批号为150675），复方金银花颗粒（O 厂家，批号为 7271607；P厂家，批号为 17051111）；山银花（灰毡毛忍冬）对照药材（批号为 121595-201202），金银花对照药材（批号为 121060-200805，121060-201107，121060-201608），灰毡毛忍冬皂苷乙对照品（批号为111814-201604），川续断皂苷乙对照品（批号为111813-201403），均购自中国食品药品检定研究院（简称中检院）。金银花（批号分别为160615，1600626，170509，20170621），山银花（批号为20170051），均购自石家庄市不同药店，由河北省药品检验研究院段吉平主任药师鉴定前者为忍冬Lonicerajaponica Thunb.，后者为灰毡毛忍冬 Lonicera macranthoides Hand.。乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）。

2 方法与结果

2.1 金银花和山银花点样量确认

取金银花对照药材和山银花（灰毡毛忍冬）对照药材各0.1 g，分别加甲醇 2 mL，超声处理15 min，取上清液作为各自的供试品溶液。另取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg溶液，作为对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液2 μL和5 μL，山银花供试品溶液 1，2，3，4，5 μL，金银花供试品溶液 2，4，6，8，10，12，15 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -浓氨试液（0.5 ∶0.5 ∶10 ∶1）为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，暗室内，通过灯光检视。山银花供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上，点样量在0.05～0.012 5 mg山银花药材均呈现相同颜色斑点，斑点分离良好，无拖尾；金银花点样量在0.1～0.75 mg内主斑点分离良好，无拖尾（见图1），但0.75 mg的点样量时主斑点足够大，已是点样的最大量。结果表明，山银花药材点样量在0.05 mg，灰毡毛忍冬皂苷乙的斑点已较明显，按测定的山银花对照药材灰毡毛忍冬皂苷乙含量7.73%计算，其含灰毡毛忍冬皂苷乙为0.003 9 mg。金银花最大点样量是山银花最低检出量的15倍。

图1 对照药材点样量确认的薄层色谱图

2.2 金银花与掺伪金银花的薄层色谱鉴别

2.2.1 薄层色谱鉴别

取掺伪2%，5%，10%，20%山银花对照药材（灰毡毛忍冬皂苷乙含量为7.73%）的金银花样品5份，分别加甲醇2 mL，超声处理15 min，取上清液，作为供试品溶液。吸取上述5种溶液及2.1项下对照药材溶液与对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -浓氨试液（0.5∶0.5∶10∶1）为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，暗室内，通过灯光检视。供试品溶液色谱中，山银花和掺伪金银花在与对照品溶液色谱相应位置上均显相同颜色斑点，而金银花在与对照品溶液色谱相应位置上无相同颜色斑点。结果表明，在金银花中山银花掺伪量达2%即可检出灰毡毛忍冬皂苷乙的斑点（见图2）。

图2 掺伪金银花的薄层色谱图

2.2.2 HPLC-ELSD 定量确认

色谱条件：采用2015年版《中国药典（一部）》山银花灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的定量方法，对掺伪2%，5%，15%的样品进行HPLC-ELSD定量测定。色谱柱为 Agilent 5 TC-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.4% 醋酸溶液（B），梯度洗脱（见表 1）；用蒸发光散射检测器检测；流速为 1.0 mL／min；柱温为 30 ℃；进样量为 5 μL，10 μL，20 μL。

表1 流动相梯度洗脱表

溶液制备：取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品、川续断皂苷乙对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含灰毡毛忍冬皂苷乙0.6 mg、川续断皂苷乙0.2 mg，作为对照品混合溶液。分别取山银花对照药材，掺伪2%，5%，15%的金银花粉末（过4号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇15 mL，称定质量，超声处理（功率为300 W，频率为40 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

测定方法：分别精密吸取对照品溶液5，20 μL，供试品溶液5～20 μL，注入液相色谱仪，以外标两点法对数方程计算灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙的含量。3个代表性掺伪样品中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量测定结果见表2和图3，其含量数据基本与添加的理论值一致。由表2可见，在金银花中掺伪的山银花，其理论上含灰毡毛忍冬皂苷乙的含量与实测值基本一致。

表2 金银花对照药材中掺伪山银花对照药材的含量测定结果（%）

2.3 金银花市售药材及对照药材中山银花的鉴别

图3 金银花对照药材中掺伪山银花对照药材测定的高效液相-蒸发光散射检测器色谱图

取4批市售金银花药材，粉碎，各取 0.1 g，分别加甲醇2 mL，超声处理15 min，取上清液，作为各自的供试品溶液。吸取上述供试品溶液，2.1项下的对照品溶液、对照药材溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（0.5 ∶0.5 ∶10 ∶1）为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，暗室内，通过灯光检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色斑点的，即判为掺伪金银花。结果表明，4批市售金银花中，3号斑点未检出灰毡毛忍冬皂苷乙；1号斑点隐约出现，掺伪在2%以下；2号斑点和5号斑点呈现较清晰，结合2.2项下的薄层色谱图分析，掺伪山银花量在5%以上（见图4）。3批不同年份生产的金银花对照药材在最大点样量 15 μL（0.75 mg）时，均未检出灰毡毛忍冬皂苷乙（见图5），即金银花在薄层鉴别探讨的点样范围内检测不到灰毡毛忍冬皂苷乙。

图4 4批市售金银花中山银花薄层色谱图

图5 3批金银花对照药材中山银花薄层色谱图

2.4 金银花制剂中山银花的检测

含金银花的复方制剂因组方不同，方中所含金银花的量相差悬殊。检测时，既要考虑金银花的取样量，还要考虑薄层展开时其他斑点的拖尾情况，所以一般点样量相当于金银花药材的0.27～0.36 mg（相当于山银花点样量0.05 mg的5～7倍）。在该剂量下，是不应检出灰毡毛忍冬皂苷乙斑点的；若检出，即认为制剂中掺伪了山银花。按上述原则，依法检测6批制剂样品，结果见图 6 和表 3。可见，4，5，7，8，9 号斑点未检出山银花的灰毡毛忍冬皂苷乙，只有山银花和点样6号斑点检出了灰毡毛皂苷乙，即说明6号斑点掺伪了山银花。

图6 市售金银花制剂中山银花的薄层色谱图

2.5 金银花及其制剂中掺伪山银花样品的定量确认

为进一步判断薄层鉴别法的准确性，分别对山银花（灰毡毛忍冬）对照药材、图5中的3批金银花对照药材和图4中的市售金银花对照药材（批号为20170601）、图6中的6批金银花制剂，采用2.3项下的灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的测定方法，进行了HPLCELSD定量检测，结果见表4和图7。由表4可见，结合金银花对照药材中掺伪山银花对照药材的含量数据分析，市售金银花4号的掺伪量为15%；清开灵片（批号为170308），按处方中金银花药材含量计，其掺伪量约在10%～15%。因掺伪山银花的含量高低影响制剂中掺伪百分数的判断，故实际检测中很难控制其准确含量。建议在正常点样量范围内，金银花药材或其制剂中不应检出灰毡毛忍冬皂苷乙斑点。

只有图7 B（山银花对照药材）、图7 D（市售金银花药材）和图7 G（清开灵片）在与灰毡毛忍冬皂苷乙与川续断皂苷乙对照品相同的保留时间，呈现相同的色谱峰，即检出了该二皂苷，且与薄层鉴别结果一致。

图7 11批样品中山银花含量的高效液相色谱-蒸发光散射检测器色谱图

金银花及其制剂中掺伪山银花的快速鉴别。取市售金银花药材0.3 g，山银花（灰毡毛忍冬）对照药材0.1 g，分别加甲醇2 mL，超声处理15 min，取上清液，作为市售金银花和山银花对照药材的供试品溶液。另取灰毡毛忍冬皂苷乙适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再取含金银花的复方制剂适量，加甲醇制成每1 mL相当含金银花0.07 g的供试品溶液。吸取上述市售金银花药材溶液5 μL、山银花对照药材1～2 μL、对照品溶液 2 μL、含金银花制剂 5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（0.5 ∶0.5 ∶10 ∶1）为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，暗室内，通过灯光检视。市售金银花药材溶液与金银花复方制剂溶液的色谱中，在与对照品溶液和对照药材溶液色谱相应位置上不应出现相同颜色的斑点，如出现则可判断在金银花药材及其制剂中掺伪了山银花。

3 讨论

于中国食品药品检定研究院购买的不同年份的3批金银花对照药材的薄层色谱和HPLC-ELSD中均未检出灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙，与文献［5-6］报道一致。2015年版《中国药典（一部）》中金银花只有1种，即忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花；而山银花有4种，即灰毡毛忍冬 Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.、红 腺 忍 冬Lonicera hypoglaucaMiq.、华南忍冬Lonicera confusaDC.或黄褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花，但市场上的主流品种是灰毡毛忍冬，偶有红腺忍冬，华南忍冬和黄褐毛忍冬较难见到。本研究中，华南忍冬和黄褐毛忍冬未检出灰毡毛忍冬皂苷乙，但因难以收集到样品（各自仅1个批号），故无法做出结论［13］。考虑到其流通量极少，市场上也就无法进行掺伪，即灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙就成了区别金银花与山银花的特征点。

表4 11批样品检测结果

由图3可知，在金银花中山银花掺伪量在2%即可检出灰毡毛忍冬皂苷乙斑点。由图5和图6可知，市售金银花（批号为20170621）和清开灵片（批号为170308）掺伪了山银花，其掺伪量按山银花对照药材的含量（灰毡毛忍冬皂苷乙7.73%和川续断皂苷乙1.02%）计算，市售金银花（批号为20170621）的掺伪量为15%，清开灵片（批号为170308，按处方中的金银花药材含量计）掺伪量在10%～15%。因掺伪山银花的含量高低影响制剂中掺伪百分数的判断，故实际检测中很难控制其准确含量。金银花药材或其制剂在正常点样量范围内（即点样量相当0.27～0.36 mg金银花药材）是不应检出明显的灰毡毛忍冬皂苷乙斑点的，如检出即可判断掺伪了山银花。

山银花与金银花的薄层主斑点是不同的。由图1可知，山银花对照药材的主斑点是灰毡毛忍冬皂苷乙，含量高，而其他斑点较小；由图4可知，金银花对照药材中不含灰毡毛忍冬皂苷乙，无此斑点呈现，但其主斑点在Rf值0.45处，远较其他斑点含量高。随着掺伪山银花量的增加，金银花的主斑点减小，灰毡毛忍冬皂苷乙的斑点增大，但具体金银花主斑点是何种成分有待进一步研究。

综上所述，本鉴别方法简便、快捷，供试品溶液和对照药材溶液均用简单的甲醇超声，上清液点样，即可。甲醇提取可排除含蔗糖制剂的蔗糖干扰，获得了清晰的薄层色谱图，可准确检测金银花及其制剂中的掺伪山银花。