硒代蛋氨酸对慢性低氧大鼠缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子的影响*

赵 宏，李 斌，刘 燕，王树林，赵 磊，王秀娟

(青海大学医学院公共卫生系，西宁 810001)

缺氧诱导因子1α(hypoxia indu-cible factor 1α，HIF-1α) 属于核转录因子，对机体内氧稳态平衡的调节起维持作用。HIF-1α可调控机体内100多种基因的表达[1]。在心脏疾病中，心肌均存在不同程度的缺血、缺氧，HIF-1α表达的增加是机体适应心肌缺血缺氧产生的代偿，可激活细胞膜上的酸敏感因子通道，造成心肌缺血损伤等[2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可有效促进血管生成，动物实验证实其对缺血性心脏病有积极治疗作用[3]。有研究证实Se-Met对缺氧大鼠血管活性物质有影响[4]，可以改善缺氧损伤。本研究拟探讨慢性低氧条件下，补Se-Met对大鼠血浆HIF-1α、VEGF水平的影响，以及对大鼠心肌细胞线粒体形态的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SD大鼠90只，SPF级，体重200 g左右，由甘肃中医药大学实验动物中心提供[合格证号：SCXK(甘)2015-0002]。

1.1.2 试剂仪器

ELISA试剂盒由上海华壹生物科技有限公司提供。多功能酶标仪购自瑞士Tecan公司，型号为Infinite M200 PRO。低压氧舱购自贵州风雷航空机械有限公司，型号为DYC-3000。透射式电子显微镜购自日本日立(HITACHI)公司， 型号为H-7650。超薄切片机购自德国Leica公司，型号为UC7。

1.2 研究方法

1.2.1 硒代蛋氨酸添加方法

硒代蛋氨酸添加量按照成年人每日硒的参考摄入量(60μg/d)进行折算，分成3个剂量组，第1组饲料中硒加入量为参考摄入量的5倍，第2组为10倍，第3组为20倍。

1.2.2 实验动物分组方法

SD大鼠分成9组(每组10只)。根据不同海拔(3000m和5000m)设组，每个海拔再分成4组：低氧3 000 m对照组(简称30组)、第1组(简称31组)、第2组(简称32组)、第3组(简称33组)；低氧5 000 m对照组(简称50组)、第1组(简称51组)、第2组(简称52组)、第3组(简称53组)；同时设常氧对照组(简称00组)。

对照组喂饲普通饲料，加硒组喂饲不同剂量加硒饲料。

1.2.3 实验方法

将大鼠分别置入模拟海拔3 000 m和5 000 m的低压低氧舱30 d。实验结束后取大鼠血(经腹主动脉)及内脏，血液放入EDTA抗凝管内，离心(3000r/min，10min)，血浆及心脏置液氮保存。采用ELISA法测定大鼠血浆HIF-1、VEGF水平。采用电镜观察心肌细胞线粒体改变，动物处死后取心肌组织切成1 mm3的小块，立即置于2.5%的戊二醛固定液中(4℃)固定2小时以上，用0.1 M磷酸缓冲液浸洗30 min、1%四氧化锇固定液4 ℃后固定2小时、乙醇梯度脱水、还氧丙烷置换10 min、环氧树脂Epon812浸透包埋，在聚合后做半超薄切片(1～2μ)、美兰染色后在光学显微镜下定位，用超薄切片机进行切片(50～70nm)，用醋酸铀、柠檬酸铅染色后，在透射式电子显微镜下观察、拍照。

1.2.4 统计学方法

数据分析采用SPSS17.0统计软件。所有结果用均数±标准差表示，多组间均数比较用方差分析，两两比较用t检验。

2 结果

2.1 各组低氧大鼠血浆HIF-1α水平比较

对00组、30组、50组进行总体及两两比较，P<0.05，3个对照组间差异有显著性，说明慢性低氧对HIF-1α水平有影响。海拔3 000 m的4个组间比较，F=4.254，P<0.005。30组与32组(P=0.015)、31组与32组(P=0.002)、32组与33组(P=0.041)的差异均有显著性(P<0.05)。低氧对照组HIF-1α水平高于补硒各组，补硒降低了HIF-1α水平，以32组下降明显。海拔5 000 m的4组间比较，F=4.165，P<0.005。50组与52组(P=0.017)、51组与52组(P=0.004)、51组与53组(P=0.039)的差异均有显著性(P<0.05)。低氧对照组HIF-1α水平高于补硒各组，补硒降低了HIF-1α水平，以53组下降明显。不同海拔组间可见HIF-1α水平随补硒量的增加而降低，5 000 m补硒各组下降明显(表1)。

表1不同海拔低氧大鼠血浆HIF-1α、VEGF水平(ng/L)

Table 1Plasma HIF-1α and VEGF levels at different altitudes in hypoxic rats(ng/L)

2.2 各组低氧大鼠血浆VEGF水平比较

对00组、30组、50组总体比较，P<0.05，3个对照组间差异有显著性，说明慢性低氧对VEGF水平有影响。海拔3 000 m组间比较，补硒各组VEGF水平均低于对照组，随补硒量增加而降低。海拔5 000 m组间比较，50组与52组(P=0.041)、51组与53组(P=0.048)、52组与53组(P=0.013)的差异均有显著性，补硒组VEGF水平高于对照组。不同海拔组VEGF水平均低于常氧对照组，VEGF水平随补硒量增加而降低(表1)。

2.3 00组、50组、52组低氧大鼠心肌细胞线粒体改变(图1)

00组 ×10000 50组 ×10000 52组 ×10000

图1示，00组大鼠心肌细胞体积较大，细胞核形状多不规则，核内染色质分布均匀；肌原纤维排列基本整齐，肌节基本完整；肌原纤维间线粒体丰富，线粒体体积较大，嵴密集。50组大鼠心肌细胞核形状不规则；肌原纤维间线粒体肿胀明显，线粒体嵴间隙增宽，部分线粒体嵴溶解成空泡状；部分肌原纤维排列不整。52组大鼠心肌细胞核形状多不规则，核内染色质分布均匀，肌原纤维排列基本整齐，肌原纤维间线粒体肿胀程度明显减轻。补硒组大鼠心肌细胞线粒体的形态明显接近于常氧对照组，对慢性低氧大鼠补充Se-Met明显减轻了低氧对心肌细胞线粒体结构的影响。

3 讨论

HIF-1α对机体内氧稳态平衡的调节起维持作用，可与其他信号通路形成复杂的网络调控系统，在细胞增殖、血管形成与重塑等方面发挥着重要作用[1]。本研究发现低氧对照组大鼠血浆HIF-1α水平明显高于常氧对照组，HIF-1α水平在低氧条件下上升，不同海拔各组大鼠饲料中补充硒代蛋氨酸后HIF-1α水平有不同程度下降，在3 000 m和5 000 m组均以中硒剂量组(32组，52组)HIF-1α水平下降明显。

HIF-1α能保护缺氧心肌，但其过度、持续激活会恶化心功能，导致心肌肥厚。心脏特异性过表达HIF-1α会降低肌质网钙-ATP酶蛋白，导致患者发生心肌病；持续增加的HIF-1α也会降低缺血性心脏病患者的心功能[5]。李永旺[6]认为，HIF-1α在动脉粥样硬化、细胞凋亡、炎症反应所致的氧化应激的发生发展中发挥重要作用，抑制HIF-1α的表达能减轻心力衰竭患者全身的炎症反应，改善血管内细胞的功能状态。因此慢性低氧条件下适当补充硒代蛋氨酸能够有效降低HIF-1α水平，减少缺氧条件下持续增加的HIF-1α对心脏组织造成的损害。

VEGF是内皮细胞的特异性有丝分裂源，低氧后VGEF表达的上调具有重要的病理生理意义[7]。本研究发现不同海拔各组大鼠饲料中补充硒代蛋氨酸后VGEF水平有不同程度下降，在3 000 m和5 000 m组均以高硒剂量组(33组，53组)VGEF水平下降最为明显。侯文艳等[8]发现，VEGF促进新血管形成，作用于肺小动脉内膜后，引起内膜增厚及介导新血管形成，肺动脉压力升高后，增加了右室后负荷而影响了心脏的结构和功能。同时，HIF-1α可以通过上调血管内皮生长因子，促进血管生成[9]。慢性低氧条件下通过补充硒代蛋氨酸能够降低VGEF水平或通过减少HIF-1α来调节VGEF水平，减少了肺动脉高压发生，进而减少了对心脏结构及功能的影响。

线粒体是真核细胞产生ATP，进行能量代谢的重要场所。心肌细胞持续不断地收缩舒张，需要消耗大量的能量，线粒体的分布、形态变化以及数量的改变不仅是其保持自身功能稳定性的基础，还在保持细胞正常活动中扮演着非常重要的角色[10]。本研究通过电镜观察各组大鼠心肌细胞线粒体形态发现，补硒组大鼠心肌细胞线粒体的形态接近于常氧对照组，对慢性低氧大鼠补充Se-Met明显减轻了低氧对心肌细胞线粒体结构的影响，改善了心肌细胞的能量供应，降低了低氧对心脏功能的影响。