饲料中黄曲霉毒素检测研究进展

付 伟，张 伟，陈江魁，王更先

（1.邯郸学院 生命科学与工程学院，河北邯郸 056005； 2.河北省高校冀南太行山区野生资源植物应用研发中心，河北邯郸 056005； 3.邯郸市农业农村局，河北邯郸 056000）

黄曲霉毒素为半知菌类腐生真菌黄曲霉和曲霉科曲霉属寄生曲霉的次生代谢产物，目前发现的至少有17 种，如黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素B2，黄曲霉毒素G1，黄曲霉毒素G2等，其中以黄曲霉毒素B1毒性最强（李昆等，2017）。黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素，B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）。黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1在体内的代谢产物。黄曲霉毒素的相对分子量为312 ～346，难溶于水易溶于油，甲醇丙酮和氯仿等有机溶剂，耐热，在强酸溶液中分解小，强碱溶液中迅速分解。由于黄曲霉和寄生曲霉易感染玉米、大豆等饲料原材料，给饲料加工、生产、保存带来困难，因此，对饲料中黄曲霉毒素的检测尤为重要。

1 黄曲霉毒素的来源及对畜禽业的危害

黄曲霉和寄生曲霉广泛存在于植物、农作物、土壤上，4 ～50 ℃均可生长，但最适宜温度为25 ～40 ℃，黄曲霉毒素形成的最低温度为5 ～12℃，最高为45℃，最适温度为20 ～30℃，因此，黄曲霉毒素广泛存在坚果、粮食等食品和饲料中。黄曲霉毒素毒性极强，为氰化钾、砒霜的10、68 倍（李昆等，2017），主要损伤机体肝脏、免 疫 系 统（易 中 华 和 彭 莉，2010 ；LIU 和WU，2010）。同时，黄曲霉毒素是目前已知的最强致癌物质之一，主要诱发肾癌、肝癌、胃癌等（周浮萍和宋诗伟，2017）。黄曲霉毒素在畜牧业的危害主要体现在引起畜禽中毒、引起畜禽饲料转化率低、免疫功能降低、产蛋量下降、畜禽大量死亡、畜产品中黄曲霉毒素残留，给养殖业带来巨大损失的同时对人的健康造成威胁（Pierron A 等，2016 ；Jiang M 等，2015 ；Marin S 等，2013）。黄曲霉毒素对其危害与饲料中黄曲霉毒素含量、饲喂时间及畜禽日龄、体质有密切关系，依据GB13078-2017 国家规定黄曲霉毒素在仔猪、雏禽浓缩料中不超过10 μg/kg，肉用仔鸭后期、生长期浓缩料不超过15 μg/kg，仔猪、雏禽配合饲料15 μg/kg。严格按照此标准执行，及时处理霉变饲料，减少黄曲霉毒素对畜禽的危害（熊江林等，2017）。

2 饲料中黄曲霉毒素的检测方法

随着科技的进步，黄曲霉毒素的检测方法越来越多样化，准确度越来越高，较为常见的黄曲霉毒素检测方法有基于仪器分析技术、抗体的免疫、适配体生物传感器及其他方法。基于仪器分析技术检测黄曲霉毒素的方法主要有高效液相色谱分析法、液相色谱- 串联质谱分析法，薄层色谱法等（马腾达等，2019）。基于免疫学检测黄曲霉毒素的方法主要有酶联免疫吸附测定法、免疫层析法、时间分辨荧光免疫分析法、免疫传感法（左晓维等，2019）。基于适配体生物传感器检测黄曲霉毒素的方法主要有试纸条法、荧光适配体传感器、聚合酶链式反应技术的生物传感器、电化学适配体传感器、表面增强拉曼光传感器等检测方法（赵颖等，2018）。

2.1 基于仪器分析技术检测黄曲霉毒素的方法

检测饲料中黄曲霉毒素最常用的方法之一为基于仪器的检测技术，如高效液相色谱法，基于仪器分析技术的检测有重现性好，灵敏度高，定量准确等优点。如郑会超等（2014）提取青粗饲料，免疫亲和柱净化后，使用高效液相色谱法对饲料中黄曲霉毒素B1、B2等检测，以甲醇∶水（45 ∶55）为流动相所建立的方法检出限分别为0.4、0.2 μg/kg，回收率超过80%。黄鑫等（2019）超高效液相色谱- 串联质谱法检测饲料中黄曲霉毒素，所建立的方法RSD 小于2.0%，回收率较高。重复性高，准确度较高。陈强胜（2018）按照国标方法及免疫亲柱对大米进行处理，使用高效液相方法进行检测，研究所建立方法的检测限为0.1 μg/kg，回收率可达到88.95%，灵敏性强，准确率高。

2.2 基于免疫学检测黄曲霉毒素的方法 随着科技发展，基于免疫学检测饲料中黄曲霉毒素的方法越来越广泛。基于免疫学检测饲料中黄曲霉毒素技术的原理是以抗体与抗原的特异性结合为基础的分析方法，其优点是操作简单、检测时间段、灵敏度高。姚静静等（2019）通过碳二亚胺法制备黄曲霉毒素抗原，并采用体内诱生腹水法制备AFB1单克隆抗体，建立AFB1的酶联免疫吸附测定方法，其检测范围达到0.014 ～1.920 ng/mL，检测限为0.014 ng/mL，灵敏度较高。任美玲（2015）通过制备量子点荧光微球免疫层析试纸条检测玉米中黄曲霉毒素发现，所建立的方法其检测范围为5 ～60 pg/mL，回收率达到97%～105%，所建方法灵敏度高，可用于检测。李静等（2014）通过建立时间分辨荧光免疫层析试纸条检测黄曲霉毒素发现，其方法回收率可达70%～120%，检测时间在 15 min 之内，相对误差较小，同时此方法于LC-MS方法进行比较误差小于15%。

2.3 基于适配体生物传感器检测黄曲霉毒素的方法 适配体生物传感器检测黄曲霉毒素的方法关键是适配体的制备，适配体是一种具有较强亲和力和识别能力的体外合成“化学抗体”（于寒松等，2015），其作用原理是化学抗体与抗原结合。建立方法的灵敏度、准确度取决于所筛选的“化学抗体”与抗原的亲和力强弱，分子量大小，结合后结构的稳定性。朱超（2017）试验制备一种检测黄曲霉毒素B1的试剂条，并建立了黄曲霉毒素B1荧光适配体检测方法，其方法检测限为0.1 ng/mL，稳定性好，检测范围较广，与进口试剂盒比较一致性较好，可用于检测黄曲霉毒素的检测。周子明等（2018）通过含有黄曲霉毒素B1的适配体制成试纸条，利用“off-on”光信号增强检测方法的灵敏度，其检测限可达50 μg/mL，检测范围广，特异性高，可用于样品检测。陈璐（2015）使用荧光素标记适配体，并利用黄曲霉毒素可使适配体结构变化，建立检测黄曲霉毒素B1和M1的生物传感器检测方法，其检测限为1.6 ng/mL，检测范围为5 ～100 ng/mL，加样回收率高，特异性好。2.4 其他方法 除上述三大类黄曲霉毒素的检测方法外，仍有多种方法用于饲料中黄曲霉毒素的检测，如基于金纳米簇荧光检测黄曲霉毒素B1方法，如张莹莹等（2018）通过制备金纳米簇，利用络合作用还原使荧光恢复建立了检测黄曲霉毒素B1的方法，该方法检测限低为0.1 ng /mL，检测范围0.1 ～10 ng/mL，其回收率较高，相对偏差较低；基于蓝光光盘技术检测黄曲霉毒素B1的方法，王海荣等（2018）通过纳米技术结合光盘，并在光盘上附着抗体，以检测黄曲霉毒素，所建立方法检测最低限度为0.5 ng/mL，检测范围为0.5 ～200 ng/mL，检测范围较广，方法灵敏度高、成本较低；基于高光谱特征选择的黄曲霉毒素检测方法，殷勇等（2019）通过对霉变玉米黄曲霉毒素光谱特征波长提取，建立霉变玉米中黄曲霉毒素的方法，其结果表明，特征波长下检测黄曲霉毒素精度较高，且该方法较为稳定可靠。

3 展望

黄曲霉毒素为强毒、强致癌物质可引起畜禽中毒，造成畜禽脏器破坏，大量死亡，对畜禽业的发展影响较大。同时由于黄曲霉毒素亦存在动物乳汁、蛋中，危害人民健康。目前检测饲料中黄曲霉毒素的方法较多，各有优缺点。如基于仪器分析技术检测黄曲霉毒素的方法优点是检测准确度高、重复性强。缺点是前处理过程繁琐，检测周期长，检测成本高，仪器设备昂贵，要专门的检测人员，大部分需要黄曲霉毒素的标准品，不适合现场操作，推广性不强。基于免疫学检测黄曲霉毒素的方法的优点是检测方法操作简单、对样品的纯度要求不高、灵敏度高，特异性强，检测限低、检测范围广、方便携带。缺点是由于样品的前处理过程减少，样品纯度不高，导致检测结果可能出现假阳性、试剂盒保存时间有限。基于适配体生物传感器检测黄曲霉毒素的方法的优点方便携带，稳定，高效，检测限低，重现性高、成本低。缺点是样品前处理复杂，步骤多，部分方法重现性较差，“化学抗体”筛选较为费时。针对不同的样品采用不同的检测方法，如样品若需要准确定量、重复性好时可选用基于仪器分析技术检测黄曲霉毒素；若样品需要快速检测，对定量要求不高时可使用基于免疫学检测黄曲霉毒素的方法。同时操作简单、数据准确可靠、重复性强、灵敏度高、所需仪器不贵重，不出现假阳性新的检测方法的探索和建立对饲料检测和畜禽业的发展有重要意义。