苦笋化学成分及其抗炎活性

卢辛甜邵 莉 赵碧清 周小江∗

（1.湖南中医药大学，湖南长沙410208；2.湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心，湖南 长沙410208）

苦笋为禾本科植物苦竹Pleioblastus amarus（Keng）keng 的嫩苗，是一种常见的美味菜肴，因为其脆嫩鲜美而深受人们的喜爱，同时，也是一种中药材，具有清热除烦、除湿、利水的功效，主治热病烦渴、湿热黄疸、小便不利、脚气等症［1-2］。其药用历史悠久，明代《本草纲目》 就有记载：“苦笋味苦甘寒，主治不睡、去面目及舌上热黄，消渴明目，解酒毒、除热气、益气力、利尿、下气化痰，理风热脚气，治出汗后伤风失音”。苦笋主要含黄酮类、酚酸类、生物碱类、苯环衍生物及微量元素等成分，具有抗氧化、抗炎、降血糖等作用［1-4］。

苦笋作为食品，人们为了其口感更佳，常在加工过程中，倒入沸水中煮，再倒入流动水中漂洗24 h 以上，以去除部分苦味［5］，但水提液被舍弃浪费了。课题组前期研究发现苦笋水提物具有显著的抗炎作用，且无不良反应，可以制作食品、片剂、胶囊、颗粒剂等［6］。

为了综合开发利用苦笋这一药食两用资源，课题组特对苦笋水提液的化学成分和抗炎活性进行研究，为苦笋水提液的深层次的开发利用提供物质基础和理论依据。本实验采用硅胶、反相硅胶、Sephadex LH-20等多种柱色谱，从苦笋水提液中分离得到11个化合物，其中，化合物1～4、6～11为首次从该植物中分离得到，化合物2、8为其抗炎活性成分。

1 材料

Bruker DRP-600 MHz 核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司，TMS 为内标）；Xevo G2-XS QTof 高分辨质谱仪（美国Waters 公司）；LC-15C 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；N-1001型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；Sephadex LH-20型羟丙基葡聚糖凝胶（美国Amersham Biosciences 公司）；Rp-18反相硅胶（40～63 μm，日本Daiso 公司）；ReproSil 100-C18色谱柱（250 mm×10 mm，5 μm，德国迈克公司）；柱色谱硅胶（200～300目，青岛海洋化工厂）；硅胶H 和薄层色谱硅胶GF254（青岛海洋化工厂）；OHAUS CP214型电子分析天平［奥豪斯仪器（常州）有限公司］；D101大孔吸附树脂（天津允开公司）；DH-160I直热式二氧化碳培养箱（上海三藤仪器厂）；XDS-100倒置显微镜（上海光学仪器厂）。DMEM培养基、标准胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素-链霉素溶液（美国Gibco 公司）；其他试剂均为分析纯。

苦笋于2017年5月购买于四川省南溪县，经湖南中医药大学中药鉴定教研室周小江教授鉴定为禾本科植物苦竹Pleioblastus amarus（Keng）keng 的新鲜嫩苗。

2 提取与分离

新鲜苦笋去壳后取65 kg，加6倍量水煎煮2次，每次0.5 h，滤过，合并滤液，减压浓缩，得浓缩液。将浓缩液加于大孔吸附树脂柱上，先用水洗脱，弃去水洗脱液，再用95% 乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，得浸膏约48 g。浸膏拌样，加于正相硅胶柱色谱柱上，石油醚-乙酸乙酯-甲醇（70 ∶30 ∶2～70 ∶30 ∶50）梯度洗脱，收集洗脱液，检识，合并成3部分（Fr.1～Fr.3）。

Fr.1（2.40 g）过Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，检识，合并成7部分（Fr.1-1～Fr.1-7）。Fr.1-3（0.14 g）经制备薄层［石油醚-乙酸乙酯（1 ∶1）］为展开剂和高效液相色谱［流动相为甲醇-水（14 ∶86）］纯化，得化合物9（3.6 mg）。Fr.1-4（0.73 g）过正相硅胶柱色谱［石油醚-乙酸乙酯（20 ∶1～1 ∶2）梯度洗脱］，检识，合并成5部分（Fr.1-4-1～Fr.1-4-5）。Fr.1-4-2经制备薄层［石油醚-乙酸乙酯（1 ∶1）］为展开剂和高效液相色谱 ［流动相为甲醇-水（35 ∶65）］纯化，得化合物5（2.1 mg）、6（2.4 mg）、7（7.1 mg）、8（2.2 mg）。Fr.1-5先过正相硅胶柱色谱［三氯甲烷-丙酮（90 ∶1～20 ∶1）梯度洗脱］，检识，合并成5部分（Fr.1-5-1～Fr.1-5-5）。Fr.1-5-1经高效液相色谱［流动相为甲醇-水（10 ∶90）］纯化，得化合物10（4.0 mg）。Fr.1-5-2经高效液相色谱 ［流动相为甲醇-水（15 ∶85）］纯化，得化合物11（2.8 mg）。

Fr.2（1.92 g）过反相C18柱色谱，甲醇-水梯度洗脱，检识，合并成3部分（Fr.2-1～Fr.2-3）。Fr.2-1过Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，检识，合并成4部分（Fr.2-1-1～Fr.2-1-4）。Fr.2-1-2过Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，检识，合并成2部分（Fr.2-1-2-1～Fr.2-1-2-2），其中Fr.2-1-2-2为化合物1（5.2 mg）。Fr.2-1-2-1先过正相硅胶柱色谱［石油醚-乙酸乙酯-丙酮（1 ∶1 ∶1）洗脱］，再经高效液相色谱［流动相为甲醇-水（20 ∶80）］纯化，得化合物2（3.5 mg）、3（2 mg）、4（4.6 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：无色晶体，分子式C13H14O6，HRESI-Q-TOF-MSm／z：267.086 1 ［M＋H］＋。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显黄 色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：8.06（1H，d，J=9.7 Hz，H-4），6.31（1H，d，J=9.7 Hz，H-3），4.02（3H，s，5-OCH3），3.97（3H，s，7-OCH3），3.93（3H，s，6-OCH3），3.90（3H，s，8-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：162.4（C-2），152.2（C-7），146.7（C-6），145.4（C-5），144.0（C-8），140.6（C-4），138.1（C-9），114.7（C-3），110.9（C-10），62.6（5-OCH3），62.3（7-OCH3），62.2（6-OCH3），61.9（8-OCH3）。以上数据与文献 ［7］一致，故鉴定为5，6，7，8-四甲氧基香豆素。

化合物2：黄色固体，分子式C14H16N2O3，HR-ESI-Q-TOF-MSm／z：261.126 0 ［M＋H］＋。易溶于甲醇，硫酸-乙醇显紫棕色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.03（2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′），6.70（2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′），4.36（1H，t，J=4.4 Hz，H-3），3.55（1H，m，H-6α），3.35（1H，m，H-6β），4.05（1H，m，H-9），3.08，3.03（2H，dd，J=5.1，14.2 Hz，H-10），2.10（1H，m，H-8α），1.81（2H，m，H-7），1.22（1H，m，H-8β）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：170.7（C-1），167.0（C-4），157.9（C-4′），132.1（C-2′，6′），127.5（C-1′），116.3（C-3′，5′），60.1（C-9），57.9（C-3），46.0（C-6），37.7（C-10），29.4（C-8），22.7（C-7）。以上数据与文献［8］一致，故鉴定为环（脯氨酸-酪氨酸）。

化合物3：白色固体，分子式C10H14N2O5，HR-ESI-Q-TOF-MSm／z：241.079 1 ［M-H］-。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显紫棕色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.81（1H，s，H-6），6.29（1H，t，J=6.8 Hz，H-1′），4.40（1H，m，H-3′），3.90（1H，m，H-4′），3.79（1H，dd，J=3.1，12.1 Hz，H-5′a），3.73（1H，dd，J=3.6，12.1 Hz，H-5′b），2.21（2H，m，H-2′），1.88（3H，s，5-CH3）；13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：166.6（C-4），152.4（C-2），138.1（C-6），111.5（C-5），88.8（C-1′），86.2（C-4′），72.2（C-3′），62.9（C-5′），41.2（C-2′），12.5（5-CH3）。以上数据与文献［9］一致，故鉴定为胸苷。

化合物4：浅黄色固体，分子式C5H6N2O2，HR-ESI-Q-TOF-MSm／z：127.050 3 ［M＋H］＋。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显紫色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.23（1H，s，H-6），1.85（3H，s，5-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：167.7（C-4），154.2（C-2），140.1（C-6），110.3（C-5），12.1（5-CH3）。以上数据与文献［10］一致，故鉴定为胸腺嘧啶。

化合物5：白色晶体，分子式C8H10O2，HRESI-Q-TOF-MSm／z：137.059 5 ［M-H］-。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显黄色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.03（2H，d，J=8.3 Hz，H-2，6），6.70（2H，d，J=8.3 Hz，H-3，5），3.68（2H，t，J=7.2 Hz，H-2′），2.71（2H，t，J=7.2 Hz，H-1′）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：156.8（C-4），131.0（C-1），130.9（C-2，6），116.1（C-3，5），64.6（C-2′），39.4（C-1′）。以上数据与文献［11］一致，故鉴定为对羟基苯乙醇。

化合物6：白色晶体，分子式C8H8O3，HRESI-Q-TOF-MSm／z：151.038 6 ［M-H］-。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显黄色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.06（2H，d，J=8.3 Hz，H-2，6），6.71（2H，d，J=8.3 Hz，H-3，5），3.52（2H，s，H-1′）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：174.6（C-2′），158.0（C-4），131.3（C-2，6），126.1（C-1），116.4（C-3，5），40.9（C-1′）。以上数据与文献［12］一致，故鉴定为对羟基苯乙酸。

化合物7：白色晶体，分子式C9H10O3，HRESI-Q-TOF-MSm／z：165.054 5 ［M-H］-。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显黄色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.00（2H，d，J=8.3 Hz，H-2，6），6.68（2H，d，J=8.3 Hz，H-3，5），2.81（2H，t，J=7.6 Hz，H-1′），2.56（2H，t，J=7.6 Hz，H-2′）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：175.3（C-3′），156.9（C-4），132.6（C-1），130.2（C-2，6），116.2（C-3，5），37.1（C-2′），31.2（C-1′）。以上数据与文献［13］一致，故鉴定为对羟基苯丙酸。

化合物8：白色固体，分子式C10H12O4，HRESI-Q-TOF-MSm／z：197.081 3 ［M＋H］＋。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显黄 色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.78（1H，s，H-2），6.69（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.62（1H，d，J=8.0 Hz，H-6），3.83（3H，s，3-OCH3），2.83（2H，t，J=7.6 Hz，H-1′），2.59（2H，t，J=7.6 Hz，H-2′）；13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：175.4（C-3′），148.9（C-4），146.0（C-3），133.5（C-1），121.7（C-6），116.2（C-5），113.0（C-2），56.3（3-OCH3），37.1（C-2′），31.6（C-1′）。以上数据与文献［14］一致，故鉴定为4-羟基-3-甲氧基苯丙酸。

化合物9：无色固体，分子式C8H10O2，HRESI-Q-TOF-MSm／z：137.059 0 ［M-H］-。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显黄色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.38～7.25（5H，m，H-2，3，4，5，6），4.68（1H，dd，J=4.7，7.4 Hz，H-1′），3.61（2H，m，H-2′）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：143.3（C-1），129.2（C-3，5），128.5（C-4），127.4（C-2，6），76.0（C-1′），68.7（C-2′）。以上数据与文献［15］一致，故鉴定为1-苯基-1，2-乙二醇。

化合物10：白色固体，分子式C14H14O3，HRESI-Q-TOF-MSm／z：231.251 2 ［M＋H］＋。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显黄 色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.75（4H，m，H-2，2′，6，6′），6.65（4H，m，H-3，3′，5，5′），3.35（6H，s，4-OCH3，4′-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：146.3（C-4，4′），146.1（C-1，1′），120.9（C-2，2′，6，6′），116.4（C-3，3′，5，5′），49.8（4-OCH3，4′-OCH3）。以上数据与文献［16］一致，故鉴定为bis（4-methoxyphenenyl）ether。

化合物11：无色晶体，分子式C13H20O2，HRESI-Q-TOF-MSm／z：207.137 4 ［M-H］-。易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显棕色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.94（1H，d，J=9.9 Hz，H-5），6.14（1H，d，J=9.9 Hz，H-6），3.81（1H，m，H-3′），2.52（1H，m，H-1′a），2.38（1H，m，H-1′b），1.89（3H，s，H-9），1.60（2H，m，H-2′），1.29（3H，s，H-7），1.28（3H，s，H-8），1.22（3H，d，J=6.3 Hz，H-9）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：188.5（C-1），165.5（C-3），160.2（C-5），132.4（C-2），126.1（C-6），68.8（C-3′），42.2（C-4），38.7（C-2′），27.9（C-1′），26.0（C-7），25.9（C-8），23.3（C-4′），11.5（C-9）。以上数据与文献［17］一致，故鉴定为3-（3′-hydroxybutyl）-2，4，4-trimethylcyclohexa-2，5-dienone。

4 抗炎活性筛选

对分离得到的化合物1～4、7～8进行抗炎活性筛选，采用LPS 诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型评价化合物抑制NO 产生的活性。

4.1 方法

4.1.1 细胞培养 RAW264.7细胞培养于10%FBS＋1%双抗的DMEM 培养基中；以上细胞2～3 d换1次液，细胞汇合率达80% 左右，胰酶消化细胞，一分为二进行细胞传代。

4.1.2 细胞铺板 取对数生长期的RAW264.7细胞，胰酶消化细胞铺板，铺1个96孔板，共60个孔，每孔100 μL 细胞悬液，每孔约1×104个细胞。在37 ℃、5% CO2的培养箱里培养24 h，待细胞贴壁后弃去旧培养液，并进行药物处理。各孔药物处理分组如下，每组3个复孔分别为空白组，只含DMEM 完全培养基，培养20 h；阴性对照组，含1 μg／mL LPS 的DMEM 完全培养基培养20 h；阳性对照组，阿司匹林浓度分别为25、50、100、200 μmol／L，并含有1 μg／mL LPS 共同处理20 h；6个加药组，每个药物的质量浓度分别为30 μg／mL，并含有1 μg／mL LPS 共同处理20 h。

4.1.3 NO 检测 取出Griess Reagent Ⅰ和Ⅱ，使恢复室温；用DMEM＋10% FBS 稀释对照品（1～100 μg／mL）；对照品质量浓度分别为0、1、2、5、10、20、40、60、100 μg／mL；分别取样品培养液上清液，按50 μL／孔，在96孔板中加入对照品及样品；按50 μL／孔，在各孔中加入室温Griess Reagent Ⅰ；按50 μL／孔，在各孔中加入室温Griess Reagent Ⅱ；在540 nm 测定吸光度。

4.2 结果 化合物2、8在30.0 μg／mL 表现出较弱的NO 抑制作用。化合物2复孔一、二、三的OD值分别为0.539 6、0.601 3、0.610 9，其平均OD值为0.583 9，其平均抑制率为37.28%。化合物8复孔一、二、三的OD值分别为0.623 5、0.556 9、0.618 4，其平均OD值为0.599 6，其平均抑制率为36.16%。对化合物2、8进行量效关系考察，根据毒性试验结果确定各化合物浓度梯度，其半数抑制浓度（IC50）分别为98.9、81.9 μmol／L。

5 讨论

本实验采用硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱等方法对苦笋水提液化学成分进行研究，从中分离得到11个化合物，其中，化合物1～4、6～11均为首次从该植物中分离得到。其中，化合物1为香豆素类，药理研究表明，这类化学成分多具有抗癌、抗炎、抗凝血及抗菌等活性［18-19］。化合物2～4为生物碱类，这类化合物多具有较好的抗炎作用［20-21］。化合物5～10为芳香族，通过适当处理可作为天然香料，具有广阔的开发前景。化合物11为烯酮类，可通过合成得到［17］。本实验对部分单体化合物进行抗炎活性筛选，确定化合物2、8为苦笋抗炎活性成分，其能较弱地抑制NO 产生，具有较弱的抗炎活性。推测生物碱和酚酸类可能为苦笋清热功效成分。以期为苦笋水提液资源价值发现，资源循环利用提供依据，也为后续研究苦笋物质基础及作用机制等提供一定的参考。