唾液链球菌的培养工艺研究

朱鸣阳

（重庆医科大学附属第二医院，重庆 400010）

益生菌被世界卫生组织（WHO）定义为摄入适当的量对食用者健康有益的一类活的微生物的总称，普遍应用于生物工程、食品安全、生命健康以及畜牧业等领域。在国外已经研究出很多益生菌保健产品[1]。唾液链球菌（Streptococcus salivarius），原名嗜热链球菌，是用于酸奶发酵的两个重要菌株之一，属于口腔正常菌群[2]。与正常人相比，口腔中的唾液链球菌数量较少者更容易口臭，这是由于口腔内一种革兰氏阴性厌氧菌代谢生成的一种挥发性硫化物是引起的[3]。研究表明，唾液链球菌最先在婴幼儿的口腔中存在，能够产生一种可参与机体生物屏障的构成，维持机体口腔菌群生态稳定的细菌素，抑制与口臭有关系的细菌[4]。此外，发酵过程中添加唾液链球菌使得酸奶的黏度有所增加，增强了酸奶的风味。同时，唾液链球菌与保加利亚乳杆菌一起发酵还存在共生效应，唾液链球菌在生长可以生成甲酸，刺激保加利亚乳杆菌繁殖，而保加利亚乳杆菌可分解酪蛋白形成多种氨基酸以及多肽，促进唾液链球菌的新陈代谢[5]。

本论文首先从美国Now foods公司生产的“诺奥清益口含片BLIS K12”中分离筛选得到唾液链球菌，并根据唾液链球菌对生长所需的六大营养物质不同需求设计了固体培养和液体培养条件，观察唾液链球菌的生长状况并对培养条件其进行优化。进行放大培养后，用平板活菌计数法检测活菌数量，并进行冻干处理，得到唾液链球菌菌粉，并总结出一条完整的工艺生产路线。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

菌株从美国Now foods公司生产“诺奥清益口含片BLIS K12”中分离筛选获得。

1.2 试验试剂

牛肉膏、胰蛋白胨、酪蛋白胨，淀粉、琼脂、酵母膏、葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、氯化钙、VitB1、脱脂乳、谷氨酸钠、吐温-80、甘油。均为化学纯。

1.3 仪器与设备

SPX-250-III生化培养箱，上海跃进有限公司产品；MA240D型电子天平，上海第二天平仪器厂产品；LS-35LD高压灭菌锅，苏州江东精密仪器有限公司产品；DNM-9606酶标分析仪，北京普朗医疗有限公司产品；LGJ-100F冷冻干燥机，松源冻干有限公司产品。

1.4 试验设计

1.4.1 固体培养条件筛选

参考已有文献对唾液链球菌的理化特性设计了四种不同的固体培养基，分别为：

唾液链球菌培养基[6]：牛肉膏4 g，蛋白胨2 g，淀粉4 g，琼脂3 g，蒸馏水200 mL，pH7.2。

MRS培养基[6]：酪蛋白胨2 g，牛肉膏2 g，酵母膏1 g，葡萄糖1 g，乙酸钠1 g，柠檬酸二胺0.4 g，吐温-80 0.2 g，磷酸氢二钾0.4 g，硫酸镁0.04 g，硫酸锰 0.001 g，碳酸钙 4 g，琼脂 3 g，蒸馏水 200 mL，pH7.2。

乳酸菌培养基[7]：酵母膏1.5 g，胰蛋白胨1.5 g，葡萄糖2 g，磷酸二氢钾0.4 g，西红柿汁20 mL，吐温-80 0.2 g，蒸馏水200 mL，pH7.2。

Eliker琼脂培养基[8]：胰蛋白胨4 g，蔗糖1 g，酵母膏1 g，氯化钠 0.8 g，乙酸钠0.3 g，葡萄糖1g，Vc0.01 g，乳糖1 g，琼脂3 g，蒸馏水200 mL，pH7.2。

将配制好的培养基放入高压灭菌锅中进行121℃灭菌20 min，待其还未凝固前倾注入灭菌平板及斜面中备用。

随后37℃下置于普通培养箱及CO2的体积分数为5%的培养箱中静置培养，记录此时为0 h，分别于12、24、48、72 h观察菌落的生长情况。

1.4.2 液体培养条件筛选

参照唾液链球菌的理化性质以及之前用到的固体培养条件，设计两种液体培养条件[9],分别为：乳糖7 g，蔗糖3.5 g，葡萄糖3.5 g，胰蛋白胨14 g，酪蛋白胨7 g，酵母膏7 g，磷酸氢二钾/磷酸二氢钾0.02 mol/L，硫酸镁200 mg/L，硫酸锰100 mg/L，氯化钙60 mg/L，VitB1 10 mg/L，蒸馏水1 L的比例配制200 mL的液体培养基，调节pH为7.2；考察不含VitB1而其他条件与前述培养基一致的条件下对唾液链球菌生长的影响。

将经过三次传代的单菌落接种到新的斜面中，静置培养18 h，将处于对数生长期的唾液链球菌接种3环至200 mL的培养液中，摇匀后37℃下置于体积分数为5%CO2的培养箱中静置培养，记录此时为0 h，分别于2、4、8、12、24 h取样，用酶标仪测量分光光度值。

1.4.3 放大培养及活菌计数

确定好液体培养条件后按照相应的比例进行放大培养，培养液总量为5 L，分别装入12个锥形瓶中，12 h后进行活菌计数，将待测样品取样稀释104、105、106倍，分别将三个稀释度的样品吸取200 μL倒入适量冷却到45℃左右试验1.4.1中的唾液链球菌培养基和MRS培养基中，混匀，冷却。待凝固后，按照试验1.4.1的条件培养，此过程严格无菌操作。培养24 h之后进行平板活菌数计数，公式为：cfu/mL＝平板中单菌落的平均数×稀释倍数×5。

1.5 冻干

放大培养12 h后，在进行活菌计数的同时，收集菌液，此时的唾液链球菌应处于平台期。将菌液在无菌条件下转移到离心杯中，转速3 500 rpm，20℃离心15 min，弃掉上清，加入3倍体积的无菌生理盐水，再次3 500 rpm，20℃离心15 min，此过程重复3次，收集沉淀，转移到无菌平板中进行冻干处理。

按照10%的脱脂乳、1.5%的谷氨酸钠、3%的甘油[10-13]配制为冻干保护剂，将加入保护剂后的菌液放入-60℃冰箱2 h进行预冻，之后再转移到冻干机里进行冻干，48 h后收集产品，称重。

2 结果与讨论

2.1 固体培养条件筛选结果

本次试验中唾液链球菌固体培养采用了分别放入两种培养箱中培养，从表1和表2的对比可以看出，相同条件下放入CO2的体积分数为5%的培养箱中的平板上菌落生长的情况更好，这可能是因为唾液链球菌是一种兼性厌氧型细菌，所以加入5%的CO2可以刺激唾液链球菌更好的生长。

表1 不同固体培养基上唾液链球菌生长情况（普通培养箱）

表2 不同固体培养基上唾液链球菌生长情况（CO2的体积分数为5%的培养箱）

对于四种不同的培养基：

第一种为普通唾液链球菌培养基，并未额外加入其他的无机盐离子，维生素等。在CO2的体积分数为5%培养箱中培养24 h后，可观察到平板上有较小的单菌落出现，数量适中。培养48 h后可见较大单菌落。

第二种为MRS培养基，除了加入必要的碳源和氮源之外，还额外加入了无机盐离子乙酸钠、柠檬酸二胺、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙。在含有5%的CO2的培养箱中培养12 h后，可观察到平板上有大量单菌落出现，24 h后可见较大的单菌落。

第三种为乳酸菌培养基，其中除了碳源氮源外，还额外加入了磷酸二氢钾和鲜榨的西红柿汁。但只有在含有CO2的培养箱中培养72 h后出现了菌落。

第四种是Eliker琼脂培养基，其中将碳源更改为乳糖，并额外加入了无机盐离子氯化钠和乙酸钠，以及抗坏血酸。但从结果显示菌落生长的情况和普通唾液链球培养基似。

2.2 唾液链球菌液体培养结果

本次试验中对比了两种液体培养基，主要区别是1号瓶中加入了VitB1作为唾液链球菌的促生长因子。

2.3 放大培养结果

放大培养后，培养液稀释106倍和107倍，采用普通唾液链球菌培养基进行活菌计数，试验结果如表3所示。

图1 不同液体培养基中唾液链球菌生长情况

表3 放大培养后活菌计数

2.4 唾液链球菌的放大培养后冻干结果

最终得到的冻干好的菌粉共计10.9 g，活菌数达到4.9×1011cfu/g。

3 结论

经过筛选得出唾液链球菌固体培养最优的条件是：酪蛋白胨2 g，牛肉膏2 g，酵母膏1 g，葡萄糖1 g，乙酸钠1 g，柠檬酸二胺0.4 g，吐温-80 0.2 g，磷酸氢二钾0.4 g，硫酸镁0.04 g，硫酸锰0.001 g，碳酸钙4 g，琼脂3 g，蒸馏水200 mL，pH 7.2，温度37 ℃下在CO2的体积分数为5%培养箱中培养。但由于配制MRS培养基较为复杂，需要按顺序加入无机盐，在工业生产中，采用普通唾液链球菌培养基条件（牛肉膏4 g，蛋白胨2 g，淀粉4 g，琼脂3 g，蒸馏水200 mL，pH 7.2）是工业生产中较好的选择。

最优的液体培养条件为：乳糖7 g，蔗糖3.5 g，葡萄糖3.5 g，胰蛋白胨14 g，大豆蛋白胨7 g，酵母提取物7 g，磷酸氢二钾/磷酸二氢钾0.02 mol/L，硫酸镁200 mg/L，硫酸锰100 mg/L，氯化钙60 mg/L，VitB1 10 mg/L，蒸馏水1 L的比例配制液体培养基，pH7.2，温度37℃下在含有5%的CO2的培养箱中静置培养。此外从图1中可以看出，唾液链球菌在培养4 h左右进入对数生长期，12 h左右进入平台期。要收集唾液链球菌可以选择在12 h左右进行收集，这为工业生产提供了有效的信息。