宝肾方胶囊制备工艺优化

秦 龙 ，李 平 ，2 ，马克君 ，王俭勤

（1．兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030； 2．甘肃省消化系肿瘤重点实验室，甘肃 兰州 730030）

宝肾方胶囊是由大黄 Rheum palmatum L．、黄芪Astragalus membranaceus（Fisch．）Bunge 和藏红花 Crocussativus组方的医院中药复方制剂，具有改善肾功能、调节脂代谢、降低尿蛋白、延缓慢性肾病进展的作用[1]。大黄中的大黄素能调节肾脏固有细胞生长，减轻肾脏炎症与免疫反应，调节细胞外基质的合成与降解[2]。藏红花中的西红花苷可调节免疫和保护肾脏[3]。黄芪中的黄芪多糖具有免疫调节、抗氧化、保肝护肾和抗肿瘤等作用[4]。为了保证宝肾方胶囊临床疗效的稳定性和连续性，本研究中在保留其传统中药汤剂特点的基础上，以浸膏得率、大黄素含量和黄芪多糖含量为考察指标，对水煎提取制备工艺进行了考察和优选。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；HP8453型分光光度计（美国惠普公司）；ME215S型电子天平（德国赛多利斯仪器有限公司）；202A-00型干燥箱（上海新正机械仪器设备厂）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

试药：大黄（批号为 20130314），黄芪（批号为20140501），均购自定西市天信药业有限责任公司；藏红花（Badiee Saffron，批号为 201210）。以上 3味中药材均经甘肃省药品检验研究院宋平顺主任药师鉴定为正品。大黄素对照品（批号为110756-200110），葡萄糖对照品（批号为110833-200904），均由中国食品药品检定研究院提供；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 大黄素含量测定

2．1．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：ZorbaxEclipseXDB-C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0．1% 磷酸溶液（85 ∶15）；检测波长：245 nm[5]；柱温：30 ℃ ；流速：1．0 mL ／min；进样量：5．0 μL。理论板数按大黄素峰计应不低于3 000，大黄素与相邻峰之间分离度均大于1．5。色谱图见图1。

2．1．2 溶液制备

称取大黄素对照品4．3 mg，精密称定，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度定容，摇匀；精密量取1．0 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度定容，摇匀，配制成每1 mL含43 μg大黄素的溶液，即得对照品溶液。分别称取9份正交试验项下浸膏样品(各 0．2 g)，精密称定，置 100 mL圆底烧瓶中，加30 mL 硫酸溶液（2．5 mol／L）超声处理 5 min，再加入30 mL氯仿，回流1．5 h，冷却至室温，转移至分液漏斗中，萃取，分取氯仿层，水相再加30 mL氯仿萃取3次，分取氯仿层，合并4次氯仿萃取液，水浴回收氯仿，置旋转蒸发仪上旋蒸至干，残渣加甲醇2．0 mL使溶解，转移至50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1．0 mL置5 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得供试品溶液。按1／2处方量配制缺大黄的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

图1 高效液相色谱图

2．1．3 方法学考察

标准曲线绘制：精密量取大黄素对照品溶液0．1，0．2，0．4，0．8，1．6，2．4 mL，分别置 10 mL 棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度定容，摇匀，配制成系列溶液，用0．22 μm微孔滤膜滤过，移至进样小瓶中，精密量取5．0 μL，自动进样，记录色谱图（图 1），以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程 Y＝62．060 4X-8．681 3，r＝0．999 9（n＝6）。结果表明，大黄素质量浓度在 0．43～10．32 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：在拟订色谱条件下，精密量取大黄素对照品溶液，重复进样6次，测定峰面积。结果的 RSD为0．16%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：在拟订色谱条件下，精密量取同一供试品溶液，分别于 0，1，2，4，6，8，10 h 时进样，测定峰面积。结果的 RSD为 0．48%（n＝7），表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

重复性试验：按1／2处方量称取样品内容物，依法制备供试品溶液，在拟订色谱条件下进样，测定峰面积并计算含量。结果大黄素平均含量为3．126 mg／g，RSD为1．21%（n＝6），表明方法重复性较好。

加样回收试验：称取已知含量的同一批浸膏样品各0．2 g，精密称定，依法制备供试品溶液，精密量取2．0 mL，置5 mL容量瓶中，再按已知含量的80%，100%，120%（低、中、高）3个体积分数，分别精密加入稀释10倍后的对照品溶液（4．3 μg ／mL）1．0，1．2，1．4 mL，加甲醇定容，摇匀，在拟订色谱条件下进样测定峰面积，计算加样回收率。结果见表1。

2．2 黄芪多糖含量测定[6]

2．2．1 溶液制备

称取葡萄糖对照品250 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加30 mL纯化水溶解，稀释至刻度定容，摇匀；精密量取1．0 mL，置50 mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，配制成每1 mL含葡萄糖0．1 mg的溶液，即得对照品溶液。分别称取9份正交试验项下浸膏样品(各 0．2 g)，精密称定，置 50 mL三角瓶中，加30mL纯化水超声处理30 min，滤过，滤液转移至100 mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，精密量取20 mL，置50 mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取2．0 mL纯化水，置10 mL干燥试管中，依次分别加入 5%苯酚溶液 1．6 mL，浓硫酸 6．0 mL，摇匀，放置30 min，作为空白溶液。

2．2．2 方法学考察

标准曲线绘制：精密量取 2．2．1项下对照品溶液0．6，0．7，0．8，0．9，1．0，1．1 mL，分别置 10 mL 干燥试管中，均加纯化水补足 2．0 mL，分别加入 5%苯酚溶液1．6 mL 和浓硫酸 6．0 mL，摇匀，室温避光放置 30 min，以空白溶液为参比溶液，按分光光度法于490 nm波长处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标、对照品溶液质量浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程A＝16．726 4 C-0．111 4，r＝0．999 5（n＝6）。结果表明，葡萄糖质量浓度在 0．03～0．055 mg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

表1 大黄素加样回收试验结果（n＝9）

精密度试验：精密量取2．2．1项下对照品溶液6份，各2．0 mL，分别置10 mL试管中，按标准曲线绘制项下方法测定吸光度。结果的 RSD为 0．21%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：分别精密量取2．2．1项下对照品溶液和供试品溶液各 2．0 mL，置10 mL试管中，按标准曲线绘制项下方法测定吸光度，前1 h每隔10 min测1次，后1 h每隔20 min测1次。结果的 RSD对照品溶液为 1．39% （n＝9），供试品溶液为 1．55% （n＝9），表明待测溶液在2 h内稳定。

重复性试验：按1／2处方量称取样品内容物，依法制备供试品溶液，按标准曲线绘制项下方法测定吸光度并计算含量。结果黄芪多糖平均含量为 45．19 mg／g，RSD为1．23%（n＝6），表明方法重复性较好。

加样回收试验：精密称取已知含量的同一批浸膏样品各0．2 g，依法制备供试品溶液，分别精密量取1．0 mL，置10 mL试管中，再按80%，100%，120%（低、中、高）3个体积分数分别加入葡萄糖对照品溶液 0．3，0．4，0．5 mL，加纯化水补足至2．0 mL，按标准曲线绘制项下方法测定吸光度。结果见表1。

2．3 制备工艺正交试验

因素与水平：采用正交试验，以加水倍数（因素A）、提取时间（因素B）和提取次数（因素C）为考察指标，每个指标选择3个水平，选用 L9（34）正交表试验。各因素及水平见表2。

表2 因素水平表

正交试验结果：按 1／2处方量称取大黄 5．0 g，黄芪 10．0 g，共 9 份，按 L9（34）正交表进行水煎提取试验，水煎液过滤，合并滤液，浓缩，移至蒸发皿中，置烘箱中60℃烘至恒定质量，分别加入西红花 1．0 g，研细，混匀。依法测定浸膏得率、大黄素含量和黄芪多糖含量，计算这3种指标的综合评分并进行方差分析。结果见表3和表4。由表3可见，水煎提取工艺影响因素的影响强度依次为C＞A＞B，即提取次数（C）＞加水倍数（A）＞提取时间（B）。由表4可见，因素 C的影响较大（P＜0．05），因素A和因素B的影响不大（P＞0．05）。故选定水煎工艺的最佳制备条件为A3B1C3，即按处方量称取大黄和黄芪，加16倍量的纯化水，水煎提取4次，每次2 h，水煎提取液合并，滤过，滤液浓缩至相对密度为1．25～1．30的浸膏，置烘箱中60℃烘至恒定质量，取出，粉碎，加入粉碎的藏红花，混匀，制粒，过80目筛，装入1号胶囊，即得。

表 3 L9（34）正交试验结果

表4 正交试验方差分析表

2．4 最佳工艺验证

为了考察最佳工艺的稳定性，在最佳制备工艺条件下分别对3批宝肾方胶囊样品进行验证，分别测定浸膏得率、大黄素含量和黄芪多糖含量，结果见表5。结果显示，优选制备工艺合理可行、稳定，可用于控制制剂的质量。

表5 最佳工艺验证试验结果（n＝3）

3 讨论

宝肾方是在现代研究的基础上，借鉴古代医家扶正益肾、除湿祛毒的辨证施治原则，并结合临床应用化裁而来的经验方。方中大黄活性成分主要为蒽醌类化合物[7]，本研究中测定大黄素含量时曾考虑测定浸膏中游离蒽醌含量，结果大黄素含量较低。故采用2015年版《中国药典（一部）》中大黄含量测定项下总蒽醌含量测定方法。曾采用甲醇 -0．1% 磷酸（90 ∶10，V／V）作为流动相，结果供试品中的大黄素与杂峰分离度小于1．5，影响检测结果，反复测试后选择流动相为甲醇-0．1% 磷酸溶液（85 ∶15，V／V）。黄芪多糖具有促进抗体生成和免疫反应等作用，其水溶性好，一般采用水煎法提取。藏红花为贵重药材，故在浸膏烘干后直接粉碎加入，避免活性成分损失。

本研究中以大黄素和黄芪多糖为主要考察指标，同时加入了浸膏得率作为辅助考察指标，这样既保留了传统中药汤剂的提取方法，又利用现在药学技术，体现了中药的整体复方功效。因此，确定以浸膏得率、大黄素含量和黄芪多糖含量3种指标的综合评分来优选最佳工艺，以保证制剂质量的稳定性。综合上述因素，按现代药剂学技术优化制备工艺条件，集成为宝肾方胶囊，以期使该制剂高效、低毒，并减少不良反应。