补肾开窍祛痰方对缺血性脑损伤大鼠海马突触可塑性的影响

杜福宏，宋良鹏，郑徳伟

(日照市中医医院 神经外科，山东 日照 276800)

脑卒中是严重危害人类健康和生命安全的常见难治性疾病，祖国医学将其列为“风、痨、臌、膈”四大疑难病之首，具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点[1]。其中，缺血性脑卒中约占卒中患者的75%左右，且易复发，给患者带来严重的经济压力和心理负担。目前，缺血性脑损伤发病机制研究主要集中在谷氨酸神经毒性、氧自由基损伤、炎性增加和神经元凋亡等[2]，而其中谷氨酸神经毒性和神经元凋亡均与神经元突触可塑性障碍有关。研究表明，海马内谷氨酸含量增加能导致突触后膜离子型谷氨酸受体NMDAR异常活化，使神经元轴突、树突复杂性下降而影响学习记忆功能[3]；神经元数量的缺失则会使突触传导功能减弱，影响大脑功能，进而导致神经精神疾病的发生[4]。补肾开窍祛痰方由《备急千金要方》中孔圣枕中丹加减而成，临床研究证实能明显改善脑卒中患者的运动能力及认知功能，具有良好的神经功能保护作用[5]，但其能否通过调节神经突触可塑性而缓解神经损伤尚未有实验研究。因此，本实验拟以缺血性脑损伤模型大鼠为研究对象，以海马突触可塑性为切入点，通过检测突触结构蛋白突触素-1(Synapsin-1)、突触后致密蛋白-95(PSD-95)和突触功能蛋白钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)、认知缺陷突触相关蛋白(SynGap)的表达情况，探讨补肾开窍祛痰方的神经保护作用及作用机制，为缺血性脑卒中的中医药防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物 补肾开窍祛痰方由熟地黄、鹿角胶、紫河车、菟丝子、益智仁、石菖蒲、升麻、全蝎等药物组成，原药材购于河南省中医院；依达拉奉注射液购自吉林博大制药公司，规格10 mL/15 mg，批号80-140712。

1.2 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠，50只，体质量为180～220 g，由上海斯莱克动物有限公司提供，生产许可证号为SCXK(沪)2017-0005。实验期间大鼠均饲养在室温(24±2)℃、相对湿度(50±5)%、光/暗周期12 h/12 h的屏障环境中，自由摄食饮水。

1.3 试剂与主要仪器 兔抗大鼠Synapsin-1、PSD-95、GAPDH单克隆抗体购自英国Abcam公司；兔抗鼠CaMKII、SynGap多克隆抗体购自美国CST公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒购自美国Thermo公司；DAB试剂盒、苏木素购自北京中杉金桥；山羊抗兔二抗购自武汉博士德公司；Axio Imager光学显微镜购自德国ZEISS；SpectraMax超微量核酸蛋白测定仪购自英国BioDrop；MK3酶标仪、RM2235手动轮转式切片机购自美国Thermo；Gel Doc XR+凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad。

1.4 动物分组、造模与给药 50只SD大鼠适应性喂养3 d后，根据体质量值随机分为2部分，其中10只为假手术组，另外40只进行缺血性脑损伤模型制备。模型制备方法根据Longa线栓法[6]改进，大鼠麻醉后，固定四肢，酒精消毒颈部，行颈部正中切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，尼龙鱼线结扎颈外动脉；在颈总动脉近分叉处插入备用鱼线，用镊子轻轻将栓线送至大脑中动脉起始处，平均进线(18.0±2.0)mm。假手术组只游离血管，不插入尼龙线。造模完成后，去除死亡大鼠，其余大鼠进行神经功能缺损评分，根据评分情况将模型大鼠随机分为4组，包括模型组、依达拉奉组、补肾开窍祛痰方低和高剂量组，每组10只。

分组完成后进行给药，依达拉奉组给予腹腔注射阳性药依达拉奉(3.2 mg/kg)，同时灌胃蒸馏水；补肾开窍祛痰方低、高剂量组分别灌胃给予该复方临床等效1、2倍剂量(8.4、16.8 g/kg)，同时腹腔注射生理盐水；假手术组与模型组灌胃蒸馏水，同时腹腔注射生理盐水。各组大鼠灌胃体积为10 mL/kg，腹腔注射体积为4 mL/kg，连续给药7 d。末次给药完成后1 h，再次对所有大鼠进行神经功能缺损评分，评分完成后麻醉大鼠，50%大鼠剥离海马于液氮中保存，另外50%大鼠经多聚甲醛灌注后取脑组织保存。

1.5 神经功能缺损评分 参照Longa评分法对大鼠进行神经功能缺损评分，评分越高，神经损伤越严重。具体为0分：无明显损伤，1分：脑缺血对侧前肢伸展不完全，2分：行走过程中转圈，3分：行走过程中倾倒，4分：不能自发行走，意识丧失。

1.6 免疫组化法检测海马CA1区突触结构蛋白的表达 取固定于4%多聚甲醛溶液中的脑组织，石蜡包埋后切片，常规脱蜡，水化，滴加山羊血清封闭液，37 ℃孵育30 min，去除血清，加一抗(Synapsin-1，1∶100；PSD-95，1∶100)4℃孵育过夜；PBS洗3次，滴加HRP标记的山羊抗兔50 μL，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，树胶封片，显微镜下观察。选取3个不同的视野，借助Image Pro软件分析积分光密度值(integral optical density,IOD)。

1.7 Western blot法检测海马突触可塑性功能蛋白的表达 取冷冻保存的海马组织，称重，加入3倍体积的RIPA裂解液，冰上匀浆，在4 ℃、12 000 rpm条件下离心15 min，取上清液，BCA试剂盒法测定总蛋白含量。制备分离胶和浓缩胶，蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳至溴酚蓝跑出分离胶后，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，根据目的蛋白分子量裁剪条带，分别加入稀释后的一抗(CaMKII，1∶500；SynGap，1∶1 000；GAPDH，1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。次日用TBST液洗涤条带4次，每次10 min，加入二抗室温下孵育4 h，TBST液洗4次，每次10 min，之后进行ECL显影。应用Image J软件分析条带灰度值，以GAPDH为内参，根据目的蛋白和内参蛋白对应灰度值的比值计算目的蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分 假手术组大鼠无神经功能缺陷症状，模型组大鼠行走时会表现出转圈或向一侧倾倒的现象，神经功能缺损明显，评分最高；与模型组比较，依达拉奉组和补肾开窍祛痰方高剂量组大鼠神经功能缺损评分显著下降(P<0.01)，同时补肾开窍祛痰方低剂量组也有较明显的改善作用(P<0.05，见表1)。

组别神经功能缺损评分给药前给药7 d后假手术0 0模型 3.05±0.543.15±0.67依达拉奉 3.08±0.511.54±0.37∗∗##补肾开窍祛痰方低剂量 3.06±0.482.21±0.40∗#补肾开窍祛痰方高剂量 3.06±0.521.92±0.34∗∗##

与模型组比较，*：P<0.05，**：P<0.01；与给药前比较，#：P<0.05，##：P<0.01。

2.2 各组大鼠海马CA1区突触结构蛋白Synapsin-1、PSD-95表达 与假手术组比较，模型组大鼠海马CA1区神经元缺失明显，细胞排列散乱，突触前膜标记蛋白Synapsin-1和突触后膜标记蛋白PSD-95阳性细胞数明显变少，积分光密度值显著减弱(P<0.01)；高剂量补肾开窍祛痰方干预后，大鼠海马CA1区神经元数量增加、排列趋于整齐，Synapsin-1、PSD-95积分光密度值显著增强(P<0.01，见图1～2、表2)。

A：假手术组；B：模型组；C：依达拉奉组；D：补肾开窍祛痰方低剂量组；E：补肾开窍祛痰方高剂量组。图1 各组大鼠海马CA1区Synapsin-1免疫组化染色结果(×400)

A：假手术组；B：模型组；C：依达拉奉组；D：补肾开窍祛痰方低剂量组；E：补肾开窍祛痰方高剂量组。图2 各组大鼠海马CA1区PSD-95免疫组化染色结果(×400)

组别Synapsin-1PSD-95假手术0.78± 0.110.81± 0.10模型0.43±0.06∗∗ 0.41±0.07∗∗依达拉奉0.71±0.09##0.68±0.08##补肾开窍祛痰方低剂量 0.59±0.07# 0.57±0.08补肾开窍祛痰方高剂量 0.68±0.10## 0.67±0.07##

与假手术组比较，**：P<0.01；与模型组比较，#：P<0.05，##：P<0.01。

2.3 各组大鼠海马突触可塑性功能蛋白CaMKII、SynGap表达 与假手术组比较，模型组大鼠海马突触可塑性功能蛋白CaMKII、SynGap表达显著下调(P<0.01)；与模型组比较，依达拉奉组和补肾开窍祛痰方高剂量组大鼠海马CaMKII、SynGap表达显著上调(P<0.01)，此外，低剂量的补肾开窍祛痰方能上调大鼠海马CaMKII蛋白的表达(P<0.05，见图3、表3)。

A：假手术组；B：模型组；C：依达拉奉组；D：补肾开窍祛痰方低剂量组；E：补肾开窍祛痰方高剂量组。图3 各组大鼠海马CaMKII、SynGap蛋白表达

组别CaMKIISynGap假手术0.51± 0.070.47± 0.07模型0.24±0.03∗∗ 0.23±0.04∗∗依达拉奉0.48±0.06##0.39±0.06##补肾开窍祛痰方低剂量 0.35±0.05#0.31±0.05补肾开窍祛痰方高剂量 0.41±0.06## 0.40±0.06##

与假手术组比较，**：P<0.01；与模型组比较，#：P<0.05，##：P<0.01。

3 讨论

缺血性脑卒中属中医“中风”、“卒中”范畴，其病机为因虚致瘀，瘀阻脑络，与肾、心、脑有关，中医防治当以益气化瘀、活血开窍为法则[7]。补肾开窍祛痰方是以《备急千金要方》中孔圣枕中丹为基础方，经化栽而得的临床经验方，全方共奏填精补髓、开窍祛痰、健脑益智之功效，在治疗脑卒中、脑瘫及其并发症等疾病上疗效显著。本研究通过探明补肾开窍祛痰方对缺血性脑损伤大鼠海马突触可塑性的影响，阐述其减缓神经损伤、保护脑组织的机制，对于该复方的进一步开发具有重要意义。

突触可塑性是指在外环境作用下，神经元形态和功能发生较为持久的适应性变化来维持神经系统的相对稳定，可分为结构可塑性和功能可塑性。生理状态下，神经信号的传递依赖突触前神经元释放的神经递质与突触后对应受体结合，将信号逐一传递，发挥生理功能；而在病理状态下，突触可塑性障碍是导致认知功能改变及多种神经系统疾病发生的重要原因[8]。Synapsin-1和PSD-95分别是突触前、后膜的标记蛋白，Synapsin-1是一种突触素，其表达水平决定了突触的数量和密度；PSD-95是突触后致密区核心构架蛋白之一，能影响突触连接的形成，反映突触结构的活性[9]。CaMKII是一种广泛分布于海马组织的多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，被称为记忆功能分子，主要表达于突触后致密部位，具有Ca2+依赖性的自动磷酸化特性[10]。SynGap是一种位于突触的Ras GTP酶激活蛋白(Ras Gap)，在突触兴奋状态下高表达，是CaMKII的主要催化底物[11]。CaMKII是Ca/CaM通路的下游信号分子，也是长时程增强(LTP)产生的关键信号，研究表明，神经兴奋传递至突触后膜，Ca2+通道开放，Ca2+大量内流并进一步激活CaM进而引发CaMKII蛋白Thr286位点磷酸化，CaMKII活化后，催化SynGap，使其Ras GTP酶活性受到抑制，从而诱导LTP的发生，最终参与调节神经元突触可塑性及机体学习记忆过程[12-13]。

本研究采用免疫组化法检测海马关键区域CA1区突触结构蛋白Synapsin-1和PSD-95的表达发现，补肾开窍祛痰方能逆转缺血性脑损伤模型大鼠突触结构蛋白的低表达水平，增强其免疫阳性；同时，检测海马组织突触功能蛋白CaMKII和SynGap表达发现，补肾开窍祛痰方能显著上调模型大鼠突触功能蛋白的表达。上述结果说明，补肾开窍祛痰方能通过调节海马神经元突触结构和功能蛋白的表达发挥神经保护作用。

综上，本研究发现，补肾开窍祛痰方能显著改善缺血性脑损伤大鼠的神经损伤情况，其作用机制可能与调节海马突触可塑性有关。本研究结果对于进一步阐明缺血性脑卒中的发病机制以及筛选治疗该疾病的复方中药提供了理论依据，下一步拟进行更深入的机制研究。