胃食管反流病相关检验项目及诊断研究

陈立柱 刘 嘉

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是胃、十二指肠内容物反流入食管，引起食管或其他部位损伤的一种消化系统常见疾病。根据食管下端病变情况，GERD分为3种类型：食管下端黏膜未破损的非糜烂性反流病(non-erosive reflux disease，NERD)、食管下端存在黏膜破损的反流性食管炎(reflux esophagitis，RE)以及食管下端上皮化生为柱状的Barrett食管(Barrett's esophagus，BE)[1]。研究表明，近10年来，胃食管反流病的发病率逐步上升，临床上的预防和治疗已引起人们的高度关注[2]。

GERD发生的原因主要是抗反流防御机制减弱和反流物攻击食管黏膜，其中抗反流机制的削弱包括下食管括约肌功能失调、食管清除能力降低和食管黏膜屏障功能下降3种情况[3]。人体进食后，食物的机械性和化学性刺激导致胃酸分泌增加，引起机体胃酸增高或胃泌素分泌下降。若食管抗反流机制削弱，十二指肠和胃内容物极易反流进入食管，刺激、损伤食管黏膜，从而导致GERD的发生和发展[4]。GERD症状多样，包括胃灼烧、反酸、胸骨后痛等典型症状和咳嗽、咽喉不适、嗳气、哮喘等非典型症状或者食管外表现[5]。诊断方法主要依靠质子泵抑制剂(proton pump inhibitor，PPI)试验，胃镜、喉镜、造影，食管反流监测，高分辨率测压等，但上述方法局限性大，大部分属于侵入性操作，患者依从性欠佳，限制了疾病的及时诊断。因此需要寻找易于接受、非侵入性的检测方法，提高GERD的检出率。血液、痰、唾液或反流物检测有操作简便、费用低、检出率高及病人检查前后无不适反应，易于接受等优势，有望成为未来GERD诊断的方向。本研究重点对潜在的新的诊断标记物发展和相关检测技术发展现状进行综述。

1 GERD潜在的诊断标记物

1.1 胃蛋白酶原和胃蛋白酶

胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)属天冬氨酸蛋白酶家族，由375个氨基酸构成，本身无活性，胃腔内胃酸可将其激活为具有生物活性的胃蛋白酶，进而水解蛋白质和多肽。人胃黏膜中包含7组胃蛋白酶同工酶原，其中PGI(PGA)由1～5组分组成，由胃底腺的主细胞分泌；PGII(PGC)由6～7组分组成，由全胃腺体和十二指肠的Brunnce腺细胞分泌[6]。PG由高尔基体分泌进入胃腔，然后少量PG通过毛细血管进入到血液循环，在血液中稳定存在[7]。

GERD患者反流物的成分主要有胃酸、胃蛋白酶、胆汁和胰酶等，其中胃酸和胃蛋白酶对食管黏膜的攻击作用最为显著[4，8]。①在GERD的发病过程中，PG由胃酸激活为有生物活性的胃蛋白酶，两者反流至食管或咽喉黏膜，导致相应部位产生病理性损害，引起GERD症状[9]；②反流到食管或咽喉部的胃蛋白酶可长时间滞留于此，当再次发生酸反流时胃蛋白酶可恢复其活性，从而再次引发烧灼感症状；③国内外报道，GERD患者唾液中的PGI浓度超过健康人群，具有显著性差异，可以作为标志物指导GERD的临床诊断[10]；④研究发现反流性食管炎、慢性萎缩性胃炎及胃癌患者体内血清PG和PGR(胃蛋白酶原比值)的变化显著，为诊断和评估病情提供重要价值[11]；⑤血清中PG含量联合GerdQ评分可作为老年GERD治疗后的随访指标，为患者提供一种敏感、无创的检查手段[12]；⑥PG作为GERD的敏感性指标有一定的局限性，由于唾液的分泌受日间活动量、饮食习惯等多因素干扰，唾液中PG检测准确性不如血清PG，导致其与疾病的相关性受到影响；⑦血清PG也受年龄、性别、幽门螺杆菌等因素影响，男性明显高于女性，PGI与PGI/PGII比值在老年组明显下降，PGII与年龄呈正相关[13]。故分析其结果时，均应思考上述影响因素。

胃蛋白酶是胃蛋白酶原经胃酸活化后形成的一类能够水解蛋白质的消化性蛋白质。最初，唾液胃蛋白酶作为诊断GERD的指标被提出，随后被多方报道验证证实[14]。目前，胃蛋白酶已在多种样本中检测到，如喉黏膜、鼻窦黏膜、唾液、中耳渗出液、气管分泌物以及肺泡黏膜灌洗液等，且已被证实与反流性疾病相关[15]。胃蛋白酶能准确反映患者咽喉反流情况，有无创、快速、准确、操作简单及客观性强等优点，已被提出作为检测GERD的新方法。但对采集样本的时机、胃蛋白测定的方法、浓度的诊断阈值和参考的诊断标准还未达成统一共识。

1.2 胃泌素

胃泌素(gastrin，GAS)是一种由G细胞分泌产生的胃肠道激素，具有促进胃肠道分泌，调节食管下括约肌张力等功能[16]。人血液循环中的GAS是由不同长度和不同序列的氨基酸多肽混合物组成，主要包含胃泌素G-34和胃泌素G-17两种异构体[17]。胃泌素G-34主要存在于十二指肠黏膜内；而胃泌素G-17占所有有活性胃泌素的80%～90%，主要存在于胃窦黏膜内，可反映胃窦G细胞数量，与血清PG临床作用相互补充[18]。研究发现，胃泌素可调节食管下端括约肌收缩，其分泌受胃酸含量控制，因此胃泌素与GERD存在密切关系，可辅助GERD的诊断治疗[19]。

胃泌素在GERD临床诊断中有一定局限性，血清G-17受幽门螺旋杆菌感染、性别、年龄、G细胞数量、胃内pH值、糖尿病和恶性贫血等多因素及疾病影响，引起临床诊断指标的异常[20]。

1.3 细胞因子

近年来的研究发现，反流性食管炎并不从食管黏膜表面化学性损伤开始，而是从黏膜下层的淋巴细胞开始，逐渐发展到黏膜表面的损伤[21]。GERD相关的炎性细胞包括食管黏膜的淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞和多型核白细胞，同时还包括食管上皮细胞、血管内皮细胞等，这些细胞产生多种炎性因子，如白细胞介素-6(interleukin，IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等[22]。

IL-6是由B细胞、单核-吞噬细胞、T细胞和血管内皮细胞等多种细胞分泌产生的糖蛋白，能够诱导B细胞、单核细胞、T细胞等分化，调节机体的免疫防御机制。研究表明，与正常组对比，食管癌患者血清IL-6水平显著升高，并且随着食管癌等级的加深，血清IL-6水平呈现增长趋势，同时研究发现术后恢复良好IL-6水平明显降低[23]。研究发现，BE患者血清和食管组织中IL-6水平较正常组也明显升高[24]。虽然BE患者缺少炎症反应，但是在BE组织中Th2相关细胞因子表达升高。IL-6作为Th2型免疫应答的重要细胞因子，其水平增高激活信号转导途径，促进BE向肿瘤方向发展[25]。因此，血清IL-6可作为食管癌诊断、病情监测和预后判断的一个有效辅助指标。

TNF-α由单核巨噬细胞产生，能够介导机体免疫调节功能，参与炎症反应过程，并能够刺激中性粒细胞产生活性氧，与反酸时食管黏膜过氧化反应密切相关[26]。研究表明，TNF-α可激活NF-κB途径，而后者是炎症和癌症发生过程中关键的调节信号分子，并且研究显示在反流性食管炎演化为BE过程中TNF-α起到一定作用[27]。

除了多种细胞因子参与GERD的形成与发展外，血清血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)也参与GERD的形成。VIP是一种含多个氨基酸残基的碱基多肽，存在胃肠道内的神经和内分泌细胞中，能够促进肠道水和电解质分泌，并参与各种细胞因子产生，调节炎症细胞功能。胃肠道上皮细胞中存在大量VIP的特异性受体，随着血液中VIP水平增加，VIP与胃肠道上皮细胞受体结合增多，导致食管下括约肌张力下降，从而诱发GERD[28]。

GERD患者与健康人群相比，血清IL-6、TNF-α、VIP水平显著升高。不同类型GERD患者中，炎性因子的水平不同，一般EE组最高，BE组次之，NERD组最低，表明糜烂性食管炎(erosive esophagitis，EE)患者食管括约肌受损相比较重，且机体存在明显炎症反应，治疗过程中应密切注意，BE及NERD患者常为慢性食管黏膜损伤，导致炎症反应相对较弱。

1.4 Claudin蛋白家族

紧密连接是维持细胞粘附的结构之一，可调节细胞的运动和功能，维持上皮组织结构的稳定。Claudin蛋白是组成紧密连接主要的骨架蛋白，与其他蛋白相互作用，维持紧密连接的结构和功能。Claudin蛋白表达异常，破坏紧密连接的完整，造成细胞粘附力下降，损害上皮组织屏障，引发多种疾病。目前发现Claudin蛋白家族的表达具有高度的组织特异性。研究表明Claudin 1、Claudin 3蛋白在食管鳞癌中显著表达，而Claudin 4蛋白在食管鳞癌中较健康组无显著性差异[29]。Claudin 4蛋白的表达主要聚集在腺体的紧密连接处，在BE和食管腺癌中异常高表达[30]。由此可见，Claudin蛋白家族有可能成为GERD的理想标志物和治疗靶点，但Claudin蛋白家族的表达规律、表达异常的应用以及与GERD临床的具体关联需进一步研究。

1.5 胆汁酸

胆汁酸是胆汁中最主要的有机成分，胆汁酸引起食管黏膜损伤与其膜表面去污性相关。①胆汁酸具有亲脂性，可溶解细胞膜脂质，引起细胞膜破坏，导致细胞损伤，能进入细胞内，使细胞内胆汁酸浓度过高，破坏细胞内膜系统，导致细胞坏死[31]；②胆汁酸盐的刺激引起氧化应激、脂质过氧化反应、自由基的产生，导致氧化应激相关基因的表达、诱导DNA损伤[32]；③由于众多基因和后生遗传的蓄积，造成BE通过化生、不典型增生，最终导致癌变；④与健康人群对比，GERD患者胃液中胆汁酸水平显著增高，且与胃黏膜损伤程度密切相关；⑤研究表明，在BE患者的食管中有更高浓度的胆汁酸(可比正常人高出10倍)，发生胆汁反流的患者比例高于其他组，BE患者中具有毒性的二级胆酸--去氧胆酸水平较其他GERD类型及消化不良患者高[33]。由此，胆汁酸可作为标志物，辅助GERD的诊断。

研究表明，胆汁酸的功能受pH值影响，在pH＞6的条件下，胆汁酸呈极性离子态，不易引起细胞损伤；在pH=3～5的条件下，胆汁酸呈无极性非离子态，极易破坏细胞和产生活性氧成分；在pH值＜3的环境中，胆汁酸沉淀，不引起食管损伤[34]。因此在治疗GERD过程中，需要将pH环境因素思考在内，更加有效的控制GERD症状。

1.6 痰及支气管肺泡灌洗液细胞学分析

胃食管反流性咳嗽是由于胃酸和其他胃内容物反流进入食管，引起的反射性咳嗽，其临床症状主要为咳嗽、反酸、胸骨后灼烧感等，容易被误诊为其他呼吸道疾病。对于原因不明的胃食管反流性咳嗽患者做痰及支气管肺泡灌洗液细胞学分析，有助于准确判断患者病情。采集深部痰或灌洗液，液化后，图涂片染色，显微镜下进行总细胞计数和分类。嗜酸性粒细胞增高，提示存在支气管哮喘、嗜酸性粒细胞支气管炎和过敏性疾病；中性粒细胞增高提示存在非哮喘性慢性咳嗽、胃食管反流性咳嗽。GRED患者治疗前后的痰细胞进行比较发现，治疗前主要是中性粒细胞和巨噬细胞，治疗后中性粒细胞明显减少，巨噬细胞和淋巴细胞数目升高。该方法学重复性好，与气管黏膜活检检测结果的相关性较好，有助于病情、治疗效果的诊断。

1.7 胃幽门螺旋杆菌

幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori，HP)是一种主要存在于胃黏膜组织中的革兰氏阴性微需氧螺旋形杆菌。HP利用自身的螺旋性特性，寄生于靠近胃黏膜上皮的粘液中，导致胃炎、胃溃疡、甚至胃癌等疾病。目前，许多研究认为HP所致的胃部炎症及炎症刺激产生一些可抑制壁细胞产酸的因子；胃窦部HP感染引起胃泌素升高，提高食管下括约肌(low esophageal sphincte，LES)的压力，加速胃排空和加快胃窦部的蠕动；HP产生氨和尿素酶，保护细菌，中和胃酸，从而导致HP感染能够抑制GERD的发展[35]。

流行病学研究提示，HP感染与GERD之间有着相互制约的关系。在发达国家HP的感染率逐步下降，而GERD的发病率却不断上升；GERD患者中的HP感染发生率较对照组明显降低[36]。临床也有胃食管返流病在HP根除后发生率增加的调查报告[37]。HP的感染人群远远多于胃食管反流人群，并且HP的感染对胃酸分泌的影响存在不确定性(有可能增加、降低和保持不变)，因此通过检测是否有HP感染可以指导和评估GERD患者的治疗效果。对伴有HP感染和GERD发病的患者，需兼顾除菌和PPI治疗。

2 相关临床或实验室诊断方法

PGI、PGII、胃泌素和细胞因子测定方法有多种，如免疫层析法、化学发光法、酶联免疫吸附法和免疫比浊法等，其中PGI、PGII以免疫比浊法最常用，胃泌素、细胞因子以免疫层析法为主。

2.1 免疫层析法

免疫层析法是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金、免疫酶或荧光物质标记，可使该区域显示一定的颜色或荧光，从而实现特异性的免疫诊断。免疫层析成本低，操作简便快速，不需任何附加设备，5～10 min即可出结果，适用于医院、卫生防疫、诊所和家庭等，主要用于定性检测或半定量检测。

2.2 化学发光法

化学发光法是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。化学发光法检测灵敏度高，自动化程度高，少量标本时相对简便。但化学发光试剂多为非开放型，试剂价格较高。发展样品小型化的化学发光仪用于即时检验(point of care testing，POCT)监测成为一个新的热点和增长点。

2.3 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后颜色变化，通过酶标仪对检测样品进行定量测定和分析，并用标准曲线对照计算出PGI含量。ELISA法具有高度的敏感性、特异性，且试剂比较稳定，无放射性污染，但存在操作复杂、耗时较长的缺点。

2.4 免疫比浊法

免疫比浊法是在一定量的抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成抗原抗体复合物，用浊度计测量反应液体的浊度，并由此推算样品中的抗原含量。免疫比浊法按测试方法可分为透射比浊法和散射比浊法。透射比浊法主要通过检测透射光强度测定抗原抗体复合物所形成的浊度，散射比浊法通过检测散射光强度测定抗原抗体复合物所形成的浊度。与透射比浊法相比，散射比浊法能很好地解决钩状效应(Hook)对测试结果的影响。由于此方法为均相反应，反应速度较快，检测时间短，临床应用的场景比较广泛，常用于特定蛋白分析仪和全自动生化分析仪，既可以用于POCT检测，也可以适用于中心实验室检测。

3 其他病理分析方法

除上述体外诊断生物标记物外，GERD也可通过内窥镜检测等病理检测技术进行辅助诊断。1999年全国反流性食管病研讨会制定了胃食管病的内镜诊断标准和内镜分类诊断方法，包括Savary Millerl51、洛杉矶分类标准及日本RE分级标准等，但上述分类方法都有一定缺陷，分级比较笼统，灵敏度等问题亟待解决，以及病理组织分级诊断标准与胃镜下诊断分级标准存在出入，待进一步研究和统一[38]。在组织病理学标记物上包括细胞间黏附分子、细胞间隙增宽等，组织电阻抗光谱法可通过内镜孔道在内镜检查时快速测量食管黏膜完整性。褚传莲等[39]报道，共聚焦激光显微内镜对非糜烂性反流病微观变化的诊断价值，可以清晰地观察到食管黏膜上皮乳头内毛细血管袢(intraepithelial papillary capillary loops，IPCLs)形态、管径的变化及细胞间隙增宽，是一种新的非糜烂性反流病检查方法。

4 展望

GERD是一种极易误诊的常见消化道疾病，存在多种非典型症状如咳嗽、哮喘、吞咽困难等，诊断存在较大困难。目前常用的检测手段侵入性强、价格昂贵，且具有一定的误诊率，因此，需要一种简便、有效及敏感性高的诊断技术。经过研究，胃蛋白酶原和胃蛋白酶、胃泌素、细胞因子、Claudin蛋白家族、胆汁酸等指标在GERD患者中具有明显的分泌异常，可作为GERD诊断标志物。虽然目前这些GERD异常标志物依旧受多种因素影响，存在各自的局限性，但是有望成为今后GERD诊断发展方向。HP无法准确作为GERD诊断标志物，但HP指标在指导GERD治疗至关重要。由于GERD患病率逐年增加和临床症状的多样性，各种筛查手段仍然需要大量试验进行验证，以提高GERD的诊断率。