紫皮石斛西洋参颗粒的研制及增强免疫力功能评价

吴月国，赵铮蓉，张萍，赵菊润，刘骅，*

（1.浙江省医学科学院，浙江杭州310013；2.龙陵县石斛研究所，云南保山678300）

紫皮石斛为兰科植物齿瓣石斛（Dendrobium devonianum Paxton.）的干燥茎，又名齿瓣石斛，收载于《云南省中药材标准》，具有益胃生津，滋阴清热等功效[1]，为我国西南各省区主要习用品种之一，石斛中的佳品[2-4]。近期，云南省卫计委发布了紫皮石斛的食品安全地方标准，现已属于药食两用管理的石斛品种。作为迄今唯一由行政主管部门发布食品安全标准的石斛品种，紫皮石斛无疑将步入发展的快车道。西洋参（Panax quinquefolium L.）具有补气养阴，清热生津等功效[5-6]，收录于卫生部发布的保健食品可用目录。紫皮石斛西洋参颗粒是以紫皮石斛复配西洋参，经现代先进工艺制成的颗粒剂，是拟以紫皮石斛为主要原料打造的高原特色产品。本研究考察了紫皮石斛西洋参颗粒的主要生产制备工艺，并评价其增强免疫力的保健功能，以期进一步的开发利用。

1 试验材料

无水葡萄糖、人参皂苷Re：中国食品药品检定研究院；苯酚：国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸：西陇化工股份有限公司；香草醛：上海双喜香料助剂有限公司；乙酸：杭州化学试剂有限公司；高氯酸：金鹿化工有限公司；乙醇：上海凌峰化学试剂有限公司；RPMI1640培养液：美国GIBCO公司；刀豆蛋白A：上海源叶生物科技服务有限公司；印度墨汁：南京都莱生物技术有限公司；绵羊血：金华利民试剂经营部；YAC-1细胞：中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。

T6新世纪分光光度计：北京普析通用仪器责任有限公司；MAX190型紫外可见连续光谱酶标仪：美国分子仪器公司；TD12001型电子天平：余姚市金诺天平仪器有限公司；AG285型电子天平：瑞士METTLER公司；XS205型电子天平：瑞士METTLERTOLEDO公司；DM4000BLED型荧光显微镜：德国莱卡公司。

铁皮石斛：龙陵县石斛研究所；西洋参：华东医药股份有限公司药材参茸分公司；ICR小鼠：浙江省实验动物中心。

2 方法

2.1 紫皮石斛西洋参颗粒制备工艺研究

紫皮石斛西洋参颗粒由紫皮石斛复配西洋参，经提取、浓缩、制粒、干燥等现代工艺精制而成，其中提取工艺步骤对产品质量的影响最为关键，需重点考察。根据紫皮石斛和西洋参有效成分的化学性质，分别通过正交试验考察用水提取和用乙醇提取对有效成分的影响，优选紫皮石斛西洋参颗粒的提取工艺。

多糖是紫皮石斛的主要有效成分之一，具有增强免疫力的功能。多糖易溶于水，宜用水进行提取，影响因素有加水量、煎煮时间、煎煮次数等，故以加水量A（20倍、30倍、40倍）、煎煮次数 B（1次、2次、3次）、煎煮时间C（3 h、4 h、5 h）为考察的因素和水平按L9（34）正交表进行正交试验[7-9]，以苯酚-浓硫酸法测粗多糖含量（以无水葡萄糖计）[5，10]，作为评价指标，筛选紫皮石斛的最佳提取工艺。

西洋参富含皂苷，宜采用乙醇回流提取，影响西洋参回流提取的因素有乙醇浓度、乙醇用量、回流时间、回流次数等，故以乙醇浓度A（30%、50%、70%）、乙醇用量 B（20倍、30倍、40倍）、回流时间 C（1 h、2 h、3 h）及回流次数D（1次、2次、3次）为考察的因素和水平按L9（34）正交表进行正交试验[11-12]，以总皂苷含量（以人参皂苷Re计）[13]为评价指标，筛选西洋参的最佳提取工艺。

确定提取工艺后，再参照中药颗粒剂的制备方法，即滤液先减压浓缩，浓缩液添加辅料制粒，干燥，整粒后得紫皮石斛西洋参颗粒，以苯酚-浓硫酸法测其粗多糖含量，按照《保健食品技术评价规范》2003年版中总皂苷的测定方法测定总皂苷含量。

2.2 紫皮石斛西洋参颗粒增强免疫力功能测定

2.2.1 小鼠分组

ICR 小鼠，SPF 级，均为雌性，体重 18 g～22 g，由浙江省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2016-0010。实验环境条件为：室温20℃～25℃，相对湿度40%～70%。根据卫生部《保健食品技术评价规范》[13]和相关科学文献[14-15]设计试验。每项实验小鼠均被分为紫皮石斛西洋参颗粒低、中、高3个剂量组（0.5、1.0、3.0 g/kg）和阴性对照组（蒸馏水），每组10只。试样灌胃体积为20 mL/kg，每天1次，连续30 d。

2.2.2 小鼠脏器/体重比值的测定

连续灌胃给予试样30 d后，颈椎脱臼法处死小鼠，取其脾脏、胸腺称重，计算脏器指数。

2.2.3 迟发型变态反应实验

实验第26天，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%压积绵羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC）悬液，进行免疫。免疫后4 d，测量左后足跖部厚度，然后于测量部位皮下再次注射20 μL20%SRBC悬液，24 h后再次测量左后足跖部厚度，计算攻击前后足跖的厚度差值。

2.2.4 小鼠脾淋巴细胞转化实验

灌胃给予试样30 d后，取脾脏制备单细胞悬液，分2孔加入24孔培养板中，一孔加刀豆蛋白A液，另一孔作为对照。置37℃、5%CO2培养箱中培养68 h，每孔加RPMI1640培养液和噻唑蓝液，再继续培养4 h加酸性异丙醇，使紫色结晶完全溶解。转移至96孔培养板中，570 nm波长处测定OD值。

2.2.5 抗体生成细胞数检测

实验第26天，每只小鼠腹腔注射0.2 mL2%SRBC悬液进行免疫，再灌胃给予试样4 d后处死动物，取脾制备单细胞悬液，按Jerne改良玻片法[15]进行实验，计算溶血空斑数。

2.2.6 血清溶血素的测定

实验第26天，每鼠腹腔注射0.2 mL 2%SRBC悬液进行免疫。4 d后，摘眼球取血，分离血清，用生理盐水将血清倍比稀释，在微量血凝板内与SRBC进行血凝实验，观察血球凝集程度，计算抗体积数。

2.2.7 小鼠碳廓清实验

连续灌胃给予试样30 d后，按10 mL/kg体重计算，尾静脉注射生理盐水稀释4倍的印度墨汁。在注射后2、10 min从内眦静脉丛取血20 μL，加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，600 nm波长测定OD值，并将小鼠处死，取肝脏、脾脏称重，计算吞噬指数。

2.2.8 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

实验第26天给每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%SRBC悬液。4 d后，每鼠腹腔注射加小牛血清的Hank's液3mL，处死小鼠，吸取腹腔洗液0.5 mL加入盛有0.5 mL 1%鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。吸取0.5 mL混合液，加入玻片的琼脂圈内。放置孵箱内37℃孵育15 min后固定，Giemsa液染色15 min。冲净，晾干，镜检，计数，计算吞噬指数。

2.2.9 NK细胞活性测定

灌胃给予试样30 d后，取小鼠脾脏制备单细胞悬液，按乳酸脱氢酶测定法[15]进行实验，在酶标仪490 nm处测定OD值，计算NK细胞活性。

2.2.10 统计学分析

各组数据用x±s表示，采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 紫皮石斛西洋参颗粒工艺优选结果

乙醇提取正交试验结果显示回流提取西洋参总皂苷的影响因素大小顺序为：A>B>C>D，即乙醇浓度对提取率的影响最大，乙醇用量次之。根据试验结果，并综合考虑生产成本和生产效率，最终确定提取条件为：A3B2C3D1，即确定西洋参提取的最佳工艺参数是：用30倍量70%乙醇回流提取3 h。

水提正交试验结果显示提取紫皮石斛粗多糖的影响因素大小顺序为：B>A>C，即煎煮次数对提取率的影响最大，加水量次之，煎煮时间对其影响相对最小。综合试验结果、生产成本等，最终确定紫皮石斛水提的提取条件为：A2B2C2。因此可以确定紫皮石斛西洋参颗粒水提的工艺参数是：30倍量水，提取2次，每次4 h。

最终根据制备工艺试验结果，确定紫皮石斛西洋参颗粒的的生产工艺为：西洋参先用30倍量70%乙醇回流提取3 h，滤渣再与紫皮石斛一起加30倍量水，提取2次，每次4 h，滤液经减压浓缩，添加辅料后流化床制粒、干燥。按照该工艺制备的紫皮石斛西洋参颗粒，经检测，粗多糖含量约为3%，总皂苷含量约为0.2%。

3.2 小鼠脏器/体重比值的测定结果

与对照组相比，紫皮石斛西洋参颗粒的3个剂量组小鼠脾脏/体重比值及胸腺/体重比值的差异均无统计学意义（P>0.05）。小鼠脏器/体重比值的测定结果见表1。

表1 小鼠脏器/体重比值的测定结果（x±s）Table 1 Effect of the spleen and thymus index on mice（x±s）

3.3 小鼠迟发型变态反应和脾淋巴细胞转化实验结果

SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，当4 d后再用SRBC攻击时，攻击部位会出现肿胀，其肿胀程度可反映迟发型变态反应程度，在本实验中，与对照组相比，紫皮石斛西洋参颗粒中、高剂量组均能显著增加小鼠左后足跖部24 h与0 h的厚度差值（P<0.05），表明细胞免疫功能阳性。如表4所示，用ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖实验中，紫皮石斛西洋参颗粒3个剂量组与对照组比较光密度值的差异均无统计学意义（P>0.05）。小鼠迟发型变态反应和小鼠淋巴细胞转化实验结果见表2。

表2 小鼠迟发型变态反应和小鼠淋巴细胞转化实验结果（x±s）Table 2 Effect of the delayed type hypersensitivity（DTH）and the transformation level of lymphoid on mice（x±s）

3.4 小鼠抗体生成细胞和血清溶血素的测定结果

小鼠抗体生成细胞和血清溶血素测定结果见表3，可见，与对照组相比，紫皮石斛西洋参颗粒3个剂量组小鼠溶血空斑数的差异均无统计学意义（P>0.05）。实验小鼠经SRBC免疫后的血清溶血素水平是反映小鼠体液免疫功能的重要指标，在本实验中，与对照组相比，紫皮石斛西洋参颗粒的3个剂量组都能显著提高小鼠的抗体积数值，差异均具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），表明紫皮石斛西洋参颗粒能增强小鼠的体液免疫功能。

表3 小鼠抗体生成细胞和血清溶血素测定结果（x±s）Table 3 Effect of the number of antibody formation cell and the serum emolysin content on mice（x±s）

3.5 小鼠碳廓清实验结果

小鼠碳廓清实验结果见表4。

表4 小鼠碳廓清实验结果（x±s）Table 4 Effect of the carbon clearance index on mice（x±s）

如表4所示，与对照组相比，紫皮石斛西洋参颗粒3个剂量组小鼠的吞噬指数的差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的实验结果

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的实验结果见表5。

表5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的实验结果（x±s）Table 5 Effect of the phagocytic ability of celiac macrophage on mice（x±s）

如表5所示，与对照组相比，各剂量均能有效提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数，其中高剂量组显著提高（P＜0.01），表明紫皮石斛西洋参颗粒能促进小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。

3.7 小鼠NK细胞活性测定结果

小鼠NK细胞活性测定结果见表6。

表6 小鼠NK细胞活性测定结果（x±s）Table 6 Effect of the activity of natural-killer cells（NK）on mice（x±s）

如表6所示，活细胞胞浆内的乳酸脱氢酶在正常情况下不能透过细胞膜，但当细胞受到NK细胞杀伤后，乳酸脱氢酶会释放到细胞外，在本实验中，与对照组相比，紫皮石斛西洋参颗粒低剂量组NK细胞活性得到明显升高（P＜0.05）。

4 结论

根据制备工艺试验结果确定了紫皮石斛西洋参颗粒的生产工艺。西洋参先用30倍量70%乙醇回流提取3 h，滤渣再与紫皮石斛一起加30倍量水，提取2次，每次4 h，过滤，滤液再经浓缩、制粒、干燥等步骤后可制备得到紫皮石斛西洋参颗粒剂产品。

紫皮石斛西洋参颗粒剂产品经增强免疫力功能评价，实验结果显示其能提高小鼠迟发型变态反应水平和血清溶血素含量，增强小鼠吞噬细胞吞噬鸡红细胞的能力，升高NK细胞活性，可判定其具有增强免疫力的保健功能，可进一步开发应用。