虎杖多糖乙醇分级纯化及其抗氧化性

王 佳，李进霞，张慧芝，徐鹏洋，陈忠琴，闫燕艳，*

(1.山西大同大学脑科学研究所，山西大同037009;2.天津大学药物科学与技术学院，天津市现代药物传递及功能高效化重点实验室，天津300072)

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)为蓼科蓼属多年生草本植物，其干燥根茎和根为药用部位，具有清热解毒、止咳化痰、利湿退黄、散瘀止痛的功效［1］，临床用于湿热黄疸、风湿痹痛、水火烫伤、跌扑损伤、痈肿疮毒等［2］。植物化学成分分析表明，虎杖中主要含有二苯乙烯类和蒽醌类化合物，此外还含有鞣质和多糖等［2］。

多糖的纯化常采用纤维素柱层析、透析和凝胶柱层析等方法，限于成本和得率，难以用于大规模生产［3］。多糖在溶剂中的溶解程度取决于其碳原子数、分子量及聚合度等多种因素［4］，乙醇分级沉淀法可通过逐步提高乙醇的体积浓度分离纯化多糖。相比其它纯化方法，乙醇分级沉淀法的优势在于，分级纯化多糖的同时仍能维持较高得率，具有广阔的应用价值，如茶多糖［3］、黄芪多糖［5］、白芨多糖［6］等。然而有关乙醇分级纯化虎杖多糖的报道较少，乙醇分级纯化过程中虎杖多糖结构及药理活性变化未见报道。鉴于此，本研究采用乙醇分级沉淀法分离出不同的虎杖多糖，并对其理化性质及抗氧化活性进行研究，探讨乙醇分级纯化对虎杖多糖含量、光谱学性质及抗氧化活性的影响，为虎杖在药品及保健食品领域中的开发利用提供实验及理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

虎杖 山西浑源万生黄芪开发有限公司;1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH) 美国 Sigma公司;D－葡萄糖、D－半乳糖醛酸 国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇、浓硫酸、三氯化铁 天津市江天化工技术有限公司，其它试剂 均为国产分析纯。

Tensor 27红外光谱仪 德国Bruker公司;UV－2450紫外分光光度计 日本Shimadzu;BSA623S分析天平 北京赛多利斯仪器有限公司;FW100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;R213B旋转蒸发仪 上海申生仪器有限公司;DK－98－ⅡA电热恒温水浴锅 天津泰斯特仪器有限公司;FD－1冷冻干燥机 上海豫康仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 虎杖多糖提取及乙醇分级纯化 参照文献［5］，将虎杖药材粉碎后称取200 g，按 1∶20(m/v)加入去离子水，于100℃水浴加热回流提取3次，每次2 h，提取液合并后，在50℃下真空旋转蒸发浓缩至40 mL，依次加入乙醇，使分级体系中乙醇浓度分别达到30%、50%、70%、90%，每调节一次浓度后，将醇沉液放置于4 ℃冰箱中静置8 h，3000 r·min－1离心15 min，取沉淀用5 mL去离子水充分溶解并冷冻，利用冷冻干燥机在－50℃真空条件下48 h干燥样品，得到对应浓度乙醇沉淀制得的4组多糖，分别标记为 PCP－30、PCP－50、PCP－70、PCP－90，称重并计算其得率。得率(%)=(粗多糖质量/原料质量)×100。

1.2.2 总糖含量测定 采用硫酸苯酚法测定总糖含量［7］，取样品300 μL，加入5%苯酚300 μL，混匀后加入浓硫酸1.5 mL，静置后测其在490 nm处的吸光值。以D－葡萄糖为标准品并绘制标准曲线(y=5.9451x+0.0361 R2=0.9943)，比较4组虎杖多糖的总糖含量。所有测定均三次重复。

1.2.3 糖醛酸含量测定 采用硫酸咔唑法测定糖醛酸含量［7］，取样品 250 μL，加入四硼法酸钠溶液1.5 mL，混匀后于100℃水浴中加热10 min，迅速冷却，加入50μL咔唑溶液，混匀后于100℃水浴中加热15 min，迅速冷却，静置后测其在525 nm处的吸光值。以D－半乳糖醛酸为标准品，并绘制标准曲线(y=0.0088x+0.029，R2=0.9975)，比较 4 组虎杖多糖的糖醛酸含量。所有测定均三次重复。

1.2.4 红外光谱分析 取待测虎杖多糖粉末，以干燥的KBr压片，采用红外光谱仪，测其在 4000～400 cm－1波长范围内的吸收光谱［8］。

1.2.5 紫外光谱 取待测虎杖多糖粉末，均配制为0.1 mg/mL的溶液，采用紫外－可见分光光度计，测其在200～400 nm波段范围内的吸收光谱［9］。

1.2.6 DPPH自由基清除活性测定 参照文献［7］，分别配制不同浓度的虎杖多糖(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL)并取 0.1 mL，加入 DPPH(120μmol/L)2.9 mL混匀，于37℃烘箱中避光30 min，在517 nm处测量吸光值。DPPH自由基清除率的计算公式为:I(%)= ［(Ablank－Asample)/Ablank］×100。以只加入溶剂的反应体系设定为空白对照，Ablank为空白对照的吸光值，Asample为样品的吸光值。

1.2.7 还原力测定 参照文献［7］，分别配制不同浓度的虎杖多糖(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL)并取0.1 mL，依次加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(p H=6.6)0.7 mL，1%铁氰化钾溶液2 mL充分混匀，于50℃水浴中反应20 min，加入10%三氯乙酸2 mL充分混匀，3000 r·min－1离心 10 min，取上清液 1 mL 加入1%三氯化铁3 mL，混匀后测其在700 nm处的吸光值。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel及SPSS软件进行数据统计及分析。

2 结果与分析

2.1 虎杖多糖得率及含量测定结果

乙醇可降低多糖水溶液的介电常数，同时减少多糖与水的作用，使多糖聚合沉淀，不同浓度的乙醇可沉淀出对应的多糖［10］。乙醇分级纯化制备的虎杖多糖的得率，总糖含量、糖醛酸含量见表1，4组多糖得率均表现出显著性差异(p＜0.05)，其中PCP－30得率最高，可达到1.065 mg/g，其次为PCP－70＞PCP－50＞PCP－90。总糖及糖醛酸含量结果显示，PCP－70和PCP－90差异不显著(p＞0.05)，其余多糖间均表现出显著性差异(p＜0.05)，4组虎杖多糖总糖含量由大到小依次为:PCP－70＞PCP－90＞PCP－50＞PCP－30，糖醛酸含量排序为:PCP－70＞PCP－90＞PCP－50＞PCP－30，与总糖含量排列趋势相同。PCP－70总糖含量及糖醛酸含量最高，且得率较高，与洪彤彤等［6］发表的研究结果相一致，其乙醇分级沉淀所得4组白芨多糖中，70%乙醇沉淀所得组分总糖含量最高。结果表明，相比其他组分，70%沉淀所得多糖组分纯度较高，杂质少，有利于多糖后期进一步的纯化及深入研究。

表1 虎杖多糖得率以及总糖、糖醛酸含量Table 1 The yields，total sugar contents and uronic acid contents of polysaccharides from Polygonum cuspidatum

2.2 虎杖多糖红外光谱分析

虎杖多糖 PCP－30、PCP－50、PCP－70 及 PCP－90的红外光谱如图1所示，3398 cm－1处有宽而强的吸收峰为多糖中O－H的伸缩振动，2924 cm－1处出现的小肩峰为 C－H 的伸缩振动，1448～1236 cm－1间的一组吸收峰为糖类化合物的C－H变角振动［9］，可初步判定4组样品均为多糖，且1643 cm－1处的吸收峰为C=O的伸缩振动，可推测其为糖醛酸结构［10］，与表1中酸性糖测定结果一致。1018～1091 cm－1间的一组吸收峰为吡喃糖环的特征峰［5］，854 cm－1处的吸收峰为 β－端基差向异构体的 C－H 变角振动［11］，762 cm－1处吸收峰为α－端基差向异构体的C－H变角振动［12］，575 cm－1附近的弱吸收峰可能为－NH2扭曲振动导致的［9］。图1结果表明，不同浓度乙醇沉淀所得4组虎杖多糖都具有多糖的典型基团，且所含基团无明显差异，可推测其化合物组成及分子结构基本相同。这与杜香多糖［13］、桑黄胞内多糖［14］分级醇沉的结果相似，分级醇沉对多糖红外光谱影响较小。

图1 虎杖多糖的红外光谱图Fig.1 FTIR spectra of polysaccharides from Polygonum cuspidatum

2.3 虎杖多糖紫外光谱分析

图2 为虎杖多糖 4个组分(PCP－30、PCP－50、PCP－70、PCP－90)的紫外扫描图谱，由图 2可知，4组多糖在260 nm处均无明显吸收，推测所得多糖中不含核酸成分，在280 nm处，4组多糖的吸收峰有明显差异，其中PCP－90吸收最明显，其次为PCP－70有较小吸收，表明PCP－90及PCP－70中均含有蛋白质，其中 PCP－90蛋白质含量最高，而 PCP－30及PCP－50吸收峰不明显，表明蛋白质含量较低。可见乙醇分级沉淀并不能完全除去多糖中的蛋白质，与李璐［15］、赵书凡［16］等得出的结果相似。

图2 虎杖多糖的紫外扫描图谱Fig.2 UV scanning spectra of polysaccharides from Polygonum cuspidatum

2.4 虎杖多糖DPPH自由基清除活性的测定结果

图3 为虎杖多糖 4个组分(PCP－30、PCP－50、PCP－70、PCP－90)的DPPH自由基清除率。结果显示，在浓度0.5～8 mg/mL范围内，4组虎杖多糖DPPH自由基清除活性均呈现浓度依赖性，浓度越大，清除率越强。比较4组虎杖多糖，PCP－70清除DPPH自由基活性最强［IC50=(4.46±0.32)mg/mL］，其次为PCP－90［IC50=(5.09 ±0.08)mg/mL］，DPPH 自由基清除率由大到小依次为:PCP－70＞PCP－90＞PCP－50 ＞PCP－30。

图3 虎杖多糖DPPH自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity against DPPH radical of polysaccharides from Polygonum cuspidatum

2.5 虎杖多糖还原力的测定结果

图4 为虎杖多糖 4个组分(PCP－30、PCP－50、PCP－70、PCP－90)的还原力试验测定吸光度值。结果显示，在浓度0.5～8 mg/mL范围内，比较4组虎杖多糖，还原力由大到小依次为:PCP－70＞PCP－90＞PCP－50＞PCP－30，PCP－70 还原力最强，PCP－30 最弱，且4组虎杖多糖的还原力均有较好的浓度依赖性，浓度越大，还原力越强，与DPPH自由基清除实验所得结果相一致。在之前的报道中，杨军国等［17］利用70%和80%乙醇沉淀制备的茶多糖中，TPs－70对DPPH清除活性及还原力均强于TPs－80，表明70%制备的多糖样品抗氧化活性更高，与本研究结果相似。

2.6 虎杖多糖活性成分与抗氧化性的线性关系

图4 虎杖多糖还原力Fig.4 Reducing power of polysaccharides from Polygonum cuspidatum

考察虎杖多糖有效成分对抗氧化性的影响，可通过SPSS软件计算Pearson相关系数进行比较，Pearson相关系数越接近1，说明该成分与对应的抗氧化活性相关性越高［7］。从表2可以看出，总糖及糖醛酸含量与DPPH自由基清除活性均有正相关性(y=0.132x－4.8417，r=0.880;y=0.2775x+1.6048，r=0.805)，总糖含量与还原力表现出正相关性(y=0.0012x－0.1863，r=0.740)，糖醛酸含量与还原力有显著的正相关性(y=0.0035x－0.3002，r=0.945，p ＜0.05)。

表2 虎杖多糖总糖含量及糖醛酸含量与DPPH自由基清除活性及还原力的Pearson相关系数Table 2 Pearson’s correlation coefficient of the contents of sugar and uronic acid in polysaccharides from Polygonum cuspidatum with the DPPH radical scavenging activity and reducing power

3 结论

本研究以虎杖为原料，采用乙醇分级沉淀法，制得4组虎杖多糖，分别为 PCP－30、PCP－50、PCP－70和PCP－90。其中PCP－30得率最高，PCP－70得率次之，PCP－70总糖含量及糖醛酸含量最高，且表现出最强的DPPH自由基清除活性及还原力，因此推测乙醇沉淀纯化虎杖多糖的最适宜体系浓度为70%，在此条件下可简单高效的实现虎杖多糖的初步提取纯化，更易实现规模化生产。红外光谱检测4组分都具有多糖的典型基团，且所含基团无明显差异。相关性结果表明，虎杖多糖总糖及糖醛酸含量与其DPPH自由基清除活性及还原力活性之间呈正相关性。结果表明，乙醇分级沉淀是分离纯化虎杖多糖简单高效的方法，有利于提高虎杖的资源利用率，为其在药品及保健食品中的广泛应用奠定基础。