PolyI∶C复合物对小鼠体内非小细胞肺癌移植瘤的作用

吴叶丹，安昌善

延边大学附属医院呼吸内科 吉林延吉133000

近年来，靶向治疗已使某些亚型的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)受益，但由于继发耐药的产生，病死率仍很高。随着肿瘤免疫治疗的发展，免疫制剂PD1等正为肺癌患者带来新的希望。Toll样受体(toll-like receptors, TLRs)作为先天免疫中最重要的跨膜受体，参与诱导和调节免疫反应[1]。TLR3位于内体膜中，其被激活可刺激癌细胞凋亡并触发炎性细胞因子的分泌，目前可作为咽、乳腺、卵巢、头颈、前列腺、口腔等部位癌症的治疗靶点[2-8]。PolyI∶C作为TLR3的配体，可激活TLR3、PKR、RIG-1和MDA5，直接诱导癌细胞凋亡并破坏肿瘤微环境[9]。研究[10]证实，PolyI∶C单独作用可诱导功能性TLR3蛋白低至中等水平表达的肺癌细胞的凋亡。本研究建立了小鼠NSCLC移植瘤模型，观察PolyI∶C在小鼠体内的抗肿瘤活性，报道如下。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器DMEM、胎牛血清、青链霉素混合液、胰蛋白酶(含0.25%EDTA)、PBS均购于美国Hyclone公司，PolyI∶C复合物(Ltd 20171101，规格3 g/L)购于北京信福医药科技有限公司，PD1(BE-0033-2-25MG，规格7.83 g/L)购于美国BioXcell公司，TUNEL试剂盒购于德国Roche公司，Thermo 细胞培养箱购于Thermo Scientific公司，低速离心机购于北京白洋仪器有限公司，倒置显微镜购于日本 OlymPus 公司。

1.2实验分组4～6周龄雌性C57BL/6小鼠，SPF级，体重16～18 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验前均在动物房适应1周，动物护理和所有实验均经北京协和医学院药物研究所实验动物伦理委员会批准。小鼠NSCLC细胞株LL/2由中国医学科学院基础医学研究所提供，用胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次以去除残存的胰蛋白酶及含血清培养液，用PBS配制成终密度为5×106个/mL的单细胞悬液。将小鼠随机分为4组，滴鼻组、肌注组、阴性对照组和PD1组，每组6只，利用LL/2细胞，依文献[11]方法制备小鼠NSCLC移植瘤模型。每2天用游标卡尺测量肿瘤直径，计算肿瘤体积，肿瘤体积=肿瘤长径×肿瘤短径2×0.5。当肿瘤体积达到100 mm3时，开始分组处理。滴鼻组每隔1天PolyI∶C滴鼻1次(0.3 mg/次)，肌注组每隔1天肌内注射PolyI∶C 1次(0.3 mg/次)，PBS组每隔1天PBS滴鼻1次(100 μL/次)，PD1组腹腔注射以PBS稀释为1 000 mg/L的PD1(100 μg/次，1周1次)。共用药2周。

1.3观察指标

1.3.1 抑瘤率 给药处理后每2天用游标卡尺测量并计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。每2天使用电子天平测量小鼠体重并绘制体重变化曲线。用药2周后将小鼠脱颈处死，剥离肿瘤组织称重，计算抑瘤率。抑瘤率=(肿瘤质量PBS组-肿瘤质量实验组)/肿瘤质量PBS组×100%。

1.3.2 移植瘤组织中细胞凋亡的检测 移植瘤称重后于甲醛溶液中固定，4 μm厚切片，用TUNEL凋亡试剂盒检测，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阳性细胞(即凋亡细胞)褐色着色。于200倍光学显微镜下选取5个代表性视野观察并拍照，使用Image J软件分析凋亡细胞百分比。

1.3.3 脏器转移情况的观察 处死小鼠时剥离肺、肝、脑等标本，用甲醛固定，进行HE染色，于40倍光学显微镜下选取5个代表性视野观察，记录各脏器转移动物数。

1.4统计学处理使用SPSS 19.0行数据分析。4组小鼠体重、移植瘤体积的比较采用重复测量数据的方差分析；抑瘤率的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1一般情况实验期间各组小鼠均精神萎靡、活动减少、饮食较差，尤以PBS组表现最明显，但无死亡。小鼠体重变化情况见表1。4组小鼠体重均逐渐增加，但从给药第13天开始，肌注组小鼠体重增加幅度小于其他3组。

2.2 3组抑瘤率的比较移植瘤体积测定结果见表2。滴鼻组和肌注组移植瘤体积较PBS和PD1组减小(P<0.05)，而肌注组移植瘤体积较滴鼻组减小(P<0.05)。滴鼻组、肌注组和PD1组抑瘤率分别为(38.33±0.05)%、(50.39±0.03)%、(15.17±0.05)%，3组比较，差异有统计学意义(F=8.177,P=0.017);滴鼻组及肌注组抑瘤率较PD1组升高(P<0.05)，肌注组抑瘤率高于滴鼻组(P<0.05)。

表1 4组小鼠体重比较 g

F组间=30.576，F时间=54.698，F交互=8.659，P均<0.001

表2 4组移植瘤体积的比较 mm3

F组间=35.252，F时间=58.326,F交互=3.490，P均<0.001

2.3 4组移植瘤组织中细胞凋亡情况的比较PBS组、滴鼻组、肌注组及PD1组凋亡细胞百分比分别为(9.15±0.61)%、(12.33±0.61)%、(13.85±0.53)%和(11.39±1.02)%，4组比较，差异有统计学意义(F=30.119，P<0.001)；滴鼻组、肌注组及PD1组肿瘤细胞凋亡均增强(P<0.05)，且肌注组变化最为显著。

2.4 4组各脏器转移情况PBS组6只小鼠均发生肝、肺转移；滴鼻组4只发生肝、肺转移；PD1组发生肝转移3只、肺转移4只；肌注组6只小鼠均未发生脏器转移。

3 讨论

目前几种TLR激动剂作为肿瘤疫苗或用于肿瘤的免疫治疗而备受关注。PolyI∶C可被TLR3、RIG1、MDA5识别，诱导转录因子(如IRF3，IRF7和NF-kB等)的激活，促进Ⅰ型IFN的释放，促进先天免疫的激活并长期促进T细胞免疫，因此作为潜在的抗肿瘤制剂具有重要意义。研究[12]表明，肺组织中TLR3的激活可以升高局部IL-5、IL-13和IgE水平，这与肺部Th2样病变高度相关。但有研究[13]结果显示，对注射mKSA细胞的小鼠重复给予PolyI∶C和肿瘤特异性抗原SV40，可诱导移植瘤的消退。

本研究中，我们将LL/2细胞种植到小鼠体内形成NSCLC移植瘤模型，观察PolyI∶C单独用药的体内抗肿瘤效果。结果显示，与PBS组比较，滴鼻组和PD1组小鼠体重变化无统计学意义，肌注组小鼠体重增加幅度大大减小；滴鼻组和肌注组移植瘤体积较PBS和PD1组减小，抑瘤率高于PD1组，且肌注组抑瘤率高于滴鼻组。滴鼻组、肌注组及PD1组移植瘤中肿瘤细胞凋亡较PBS组增强，且肌注组变化最为显著。PBS组6只小鼠均发生肝、肺转移；滴鼻组4只发生肝、肺转移；PD1组发生肝转移3只、肺转移4只；肌注组6只小鼠均未发生脏器转移。上述结果提示，PolyI∶C复合物在小鼠体内具有抗肺肿瘤活性，肌注给药的效果好于滴鼻给药，但副作用较大。

综上所述，PolyI∶C复合物在小鼠体内具有显著的抗肿瘤、抗转移作用，但是其体内抗肿瘤作用的相关分子机制仍需进一步研究。