响应面法优化莪术多糖提取工艺△

唐森，农佳慧，赵海燕，吴国勇，张鹏*

1.广西科技师范学院 食品与生化工程学院，广西 来宾 546119；2.广西科技师范学院 特色瑶药资源研究与开发重点实验室，广西 来宾 546119

莪术，姜科姜黄属多年生宿根草本，别名乌姜、姜七、黑心姜、蓝心姜等，主产于四川、广西、浙江。莪术的根茎性温，具有苦味和辛味，在医药行业中，常用于化瘀行气、消积止痛等，其主要成分莪术油在临床上用于治疗肿瘤、病毒和预防早孕等。莪术多糖具有降血脂、降血糖、增强免疫力等功能[1-3]。现代药理学研究证实，莪术具有抗癌、抗炎、抗血栓、保肝、降血脂等作用[4-9]。研究证明，植物多糖是药用植物水煎剂的主要成分，具有复杂的生物活性和功能，被认为是中药发挥传统治疗作用的主要药效物质之一。近年来，由于不同植物来源的多糖结构组成复杂多变、功能活性多种多样，关于多糖提取、分离等研究受到学者们的重视。

目前常用的植物多糖提取方法有溶剂提取法、超声波辅助溶剂提取法、微波辅助溶剂提取法、超声-微波协同提取法、酶解法、超临界流体萃取法等[10-13]。热水提取法是目前最常用的植物多糖提取方法，其具有操作简单、设备要求低、提取产物绿色无污染等优点。响应面试验设计是一种回归试验设计方法，通过相关实验采集数据，采取多元二次回归方程进行拟合自变量(试验因素)和响应值(试验指标)之间的函数关系，建立相应的数学模型，对二次多项式回归方程的计算分析来寻求最优工艺参数，是解决多变量问题的一种统计方法，其预测结果可信度高，能够快速确定多因素系统的最佳实验条件[14-15]。本实验拟以莪术为原料，采用热水提取法对莪术多糖进行提取，在单因素试验基础上，采用响应面法试验设计对莪术多糖的热水提取条件进行优化，以确定莪术多糖的最佳提取工艺条件，为以莪术为原料的植物多糖在中医药领域的进一步开发和利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

循环水多用真空泵[SHZ-D(III)型，巩义市科瑞仪器有限责任公司]；恒温水浴锅(HH-S4型，金坛市医疗仪器厂)；数控超声波清洗器(KQ-300DB型，昆山市超声仪器有限公司)；紫外/可见分光光度计[UV-9600型，北京北分瑞利分析仪器(集团)公司]；台式高速冷冻离心机(H3-20KR型，湖南可成仪器设备有限公司)；电子分析天平(FA-2004B型，上海越平科学仪器有限公司)；玻璃仪器气流烘干器(C-20型，上海贝仑仪器设备有限公司)；中草药粉碎机(FW-135型，天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试药

葡萄糖、浓硫酸、石油醚(沸程30～60 ℃)苯酚、乙醇、正丁醇、三氯甲烷均为国产分析纯试剂，蒸馏水。

莪术采购于亳州市众益堂中药材销售有限公司，经广西科技师范学院特色瑶药资源研究与开发重点实验室张鹏博士鉴定为莪术正品。

2 方法

2.1 莪术多糖的提取

干燥莪术经中草药粉碎机粉碎。称取粉碎过筛(80目)的莪术粉末40 g置圆底烧瓶中，采用索氏提取器用石油醚提取2.0 h脱脂后，过滤，滤渣挥干溶媒备用。精确称取1.00 g 莪术固体粉末，按试验设计方案所需提取温度、提取时间、液料比进行提取操作，所得提取液经抽滤，离心，减压浓缩回收溶剂至一定体积，即得莪术粗多糖提取液。

2.2 标准曲线的绘制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取0.010 0 g葡萄糖对照品置于100 mL容量瓶中，加入适量蒸馏水定容，充分摇匀，得到100 μg mL-1葡萄糖对照品溶液。放置于4 ℃冰箱储存备用。

2.2.2 对照品标准曲线的测定 分别吸取 100 μg mL-1葡萄糖对照液0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL分置于具塞试管中，各加蒸馏水至2.0 mL，再加质量分数为 6%的苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL(与液面垂直加入，勿接触试管壁，便于反应液充分混合)，摇匀后室温放置5 min，然后将具塞试管放置于40 ℃水浴中反应20 min，取出冷却至室温。另以蒸馏水同上操做作，此为空白对照，在最大吸收波长490 nm处测定吸光值[16-17]。以葡萄糖质量浓度(μg mL-1)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=0.083 2X-0.017 04，r=0.999，线性范围为3.75～11.25 μg mL-1。

图1 葡萄糖和莪术多糖显色后400～800 nm全波长扫描图

2.3 莪术多糖提取率的测定

吸取2 mL莪术粗多糖提取液于容量瓶中，加入适量蒸馏水进行稀释，精密吸取2 mL莪术粗多糖稀释液于具塞试管中，加入Savage试剂(V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1)，混匀，2000 r min-1离心20 min，将上清液转至刻度试管中，得到供试品溶液[18-19]。按照项2.2项下方法测定吸光度，按公式(1)计算莪术粗多糖溶液中多糖的含量。

莪术多糖提取率=(C×D×V)/M×100%

(1)

式中：C为供试液多糖质量浓度(μg mL-1)，D为稀释倍数，M为样品质量(μg)。V为最初样品定容体积(mL)。

2.4 莪术多糖提取的单因素试验

以液料比、提取温度、提取时间为单因素进行试验，筛选出各因素的最适条件。

2.4.1 液料比对莪术多糖提取率的影响 固定提取时间为60 min，提取温度为80 ℃的条件下，考察不同的液料比100∶1、120∶1、140∶1、160∶1、180∶1对莪术多糖提取率的影响。

2.4.2 提取温度对莪术多糖提取率的影响 固定料液比为140∶1，提取时间为60 min，考察不同提取温度50、60、70、80、90 ℃对莪术多糖提取率的影响。

2.4.3 提取时间对莪术多糖提取率的影响 固定液料比为140∶1，提取温度为80 ℃，考察不同提取时间30、60、90、120、150、180 min对莪术多糖提取率的影响。

2.5 BBD响应面试验设计

在单因素试验的基础上，使用软件Design-Expert(版本8.0.6)中Box-Behnken Design(BBD)进行试验设计，选取液料比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)3个对莪术多糖提取效果有影响的试验因素为自变量，分别以1、0、-1对每个自变量的高、中、低实验水平进行编码。以莪术多糖提取率(Y)为响应值，建立三因素三水平BBD响应面试验研究，利用D-E软件对实验结果进行数据处理分析，各实验因素及水平设计见表1。

表1 BBD响应面试验因素与水平表

2.6 验证实验

3 结果与分析

3.1 莪术多糖提取的单因素试验

3.1.1 液料比对莪术多糖提取率的影响 见图2，液料比为140∶1时多糖提取率达到峰值，为1.11%。料液比达到140∶1以后多糖提取率缓慢下降，这是因为增大溶剂用量，使过多无用的杂质溶入到了溶液中，同时也为后续回收溶剂的操作带来不便。因此确定最佳液料比为140∶1 。

图2 液料比对多糖提取率影响

3.1.2提取温度对莪术多糖提取率的影响 见图3，当提取温度为80 ℃时，多糖提取率达到峰值，为1.35%。当继续升高提取温度后，多糖提取率呈下降趋势。当温度高于80 ℃后，由于高温使热稳定性差的多糖结构发生降解从而造成多糖提取率降低。因此确定最佳提取温度为80 ℃。

图3 提取温度对多糖提取率影响

3.1.3提取时间对莪术多糖提取率的影响 见图4，提取时间为150 min时，多糖提取率达到最大值，为1.57%。当提取时间达到150 min后多糖提取率下降，由于时间过长，一方面杂质成分也随着提取出来，另一方面长时间煎煮会导致多糖稳定性下降。因此确定最佳提取时间为150 min。

图4 提取时间对多糖提取率影响

3.2 BBD响应面试验

3.2.1 响应面试验设计 根据响应面法设计三因素试验考察，本次实验共有分为两种类型的17个试验点，第一类为析因点，是自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点，析因点共有12个。第二类为位于区域中心的各自变量均为零水平的重复试验点，用来检验回归方程与中心试验点的拟合情况，同时可以提供剩余自由度，以提高试验的精度，本次试验设计的零点实验重复5次。对软件设计出的试验方案见表2，按2.1项进行多糖提取试验，按公式(1)求得相应条件下的多糖提取率。应用Design expert 8.0.6.1软件对所得试验结果进行分析，所得结果见表 3。

表2 响应面设计及结果

表3 响应面方差分析结果

注：*P<0.05，**P<0.01；r=0.985 8。

以 A、B、C(提取时间)为自变量，Y(多糖提取率)为响应值，建立莪术多糖提取率与提取条件的二次多项式回归方程：Y=1.57-0.047A+0.11B-0.006 25C+0.012AB+0.012AC-0.015BC-0.1A2-0.14B2-0.11C2。

由表3回归模型方差分析结果可知：选用模型P<0.000 1，F=53.88，说明该二次回归模型极显著，具有统计学意义。失拟项不显著(P=0.276 8>0.05)，试验误差较小，不存在失拟因素。模型r=0.985 8，说明有约98.58%的莪术多糖提取率的变化可以用该模型来解释。综上所述，该模型拟合程度较好，可以用来优化和预测莪术多糖最佳提取工艺条件。由二次回归方程系数的显著性检验可知，A、B对莪术多糖提取率的影响差异有统计学意义(P<0.01)；二次项A2、B2、C2对提取率的影响差异有统计学意义(P<0.01)。试验因数A、B、C对莪术多糖提取率的影响大小依次为：B>A>C。

3.2.2等高线图和3D响应面图分析 为直观地考察各个因素之间的交互作用对提取率的影响，以莪术多糖提取率(Y)为响应值运用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析，得到由响应值与自变量A、B、C 所构成的3D响应面图及其二维平面上投影所得的等高线图。分析结果见图5～7。

从图5可知：当液料比增大时，多糖提取率的变化趋势为先增大后减小。但是当提取溶剂使用过量时，扩散达到平衡，增大提取溶剂量不会促进多糖的溶出，反而影响溶剂的回收效率。当液料比一定时，随提取温度的增加，多糖的提取率变化趋势为先增加后降低。从图中可明显看出液料比的曲线比提取温度的曲线更陡峭，表明提取温度和液料比交互时，液料比影响响应面值变化程度更为敏感，即料液比的交互作用对莪术多糖的提取率影响较大。

图5 多糖提取率随温度和料液比变化的响应面与等高线

由图6可知：等高线近似椭圆形，表明提取时间和料液比交互关系显著。当提取时间固定时，莪术多糖提取率随液料比的增大呈现出先升高后降低的趋势。在液料比较少的情况下，提取溶液容易达到饱和。增大溶剂用量，使过多无用的杂质溶入到了溶液中，同时也为后续回收溶剂的操作带来不便。料液比和提取时间的曲线陡峭程度相近，说明两因素对多糖提取率的影响程度相差不大。

从图7可知，在温度固定时，莪术多糖的提取率随着提取时间增长呈现出也先升高后降低的趋势。当提取时间固定，随着温度增加时，多糖提取率先升高后降低。观察其陡峭程度，可看出时间的曲线比温度的曲线更陡峭，则时间对响应面值的影响程度比提取温度的影响程度高。

图6 多糖提取率随时间和液料比变化的响应面与等高线

图7 多糖提取率随时间和温度变化的响应面与等高线

3.2.3 响应面模型验证 经过响应面优化分析后，最终得出优化后莪术多糖的提取工艺条件为：液料比135.67∶1，提取温度83.63 ℃，提取时间148.02 min，预测得到莪术多糖提取率的理论值为1.592 6%。为验证结果的准确性，采用上述优化参数提取莪术多糖，考虑到试验条件的实际可操作性，将工艺参数修正为液料比136∶1，提取时间148 min，提取温度84 ℃。该工艺合理、可行。

4 结论

本研究在单因素试验的基础之上，选取提取温度、提取时间、液料比为考察因素，利用Box-Behnken方法进行三因素三水平试验设计优化莪术多糖的提取工艺。实验结果表明，建立的二元多项式回归方程的拟合情况较好，由其预测并根据实际情况进行修正后的莪术多糖提取最佳工艺为：液料比136∶1，提取时间148 min，提取温度84 ℃。在该提取条件下多糖实际提取率(1.593±0.005)%。可见，运用响应面法优化莪术多糖提取工艺参数合理可靠，为后续莪术多糖进一步研究提供相应依据，为扩大传统中药莪术的应用范围提供帮助。